抗豪豬大腸埃希菌卵黃抗體的制備及抑菌性研究

張保平，李 娜，高惠林，王前光，任國冀，童學勤

(1.常德職業技術學院 農林工程系，湖南 常德 415000； 2.湖南文理學院 動物學湖南省高校重點實驗室，湖南 常德 415000；3.湖南省桃源縣堆金豪豬養殖基地，湖南 桃源 415000)

抗豪豬大腸埃希菌卵黃抗體的制備及抑菌性研究

張保平1，李 娜2*，高惠林1，王前光1，任國冀1，童學勤3

(1.常德職業技術學院 農林工程系，湖南 常德 415000； 2.湖南文理學院 動物學湖南省高校重點實驗室，湖南 常德 415000；3.湖南省桃源縣堆金豪豬養殖基地，湖南 桃源 415000)

本試驗采用甲醛滅活仔豪豬腹瀉大腸埃希菌作為免疫抗原，翅靜脈注射免疫140日齡桃源蛋雞，使機體免疫應答生成血清抗體和卵黃抗體，利用平板凝集試驗檢測抗體滴度，研究獲得含高滴度血清和高免雞蛋的最佳條件。結果表明，翅靜脈注射大腸桿菌液最佳免疫劑量是每次1 mL，菌液濃度是1×1012mL-1。在大腸桿菌液中添加等劑量完全弗氏佐劑對免疫應答增強的程度最高。免疫強化程序能有效增強產蛋雞的免疫應答強度，初免以后，每隔1天強化免疫1次，連續4次免疫，效果最好。體外抑菌性試驗結果表明,制備的卵黃抗體對大腸埃希菌具有明顯抑制其生長的作用，但是對沙門氏菌的抑制作用比較小。本研究制備的卵黃抗體滴度和血清抗體滴度變化幅度小、持續時間長、穩定性好，為臨床上防治仔豪豬腹瀉大腸埃希菌病提供新的手段。

大腸埃希菌； 豪豬； 卵黃抗體； 制備； 抑菌性

豪豬(porcupines)，又稱箭豬、刺豬。在動物分類學上屬于哺乳綱、嚙齒目、豪豬科[1- 3]，是一種經濟價值很高的珍稀動物，具有食用價值、藥用價值和觀賞價值[4- 5]。豪豬的抗病能力很強，很少發生疾病，仔豪豬腹瀉是引起豪豬死亡的主要病因。

雞卵黃抗體(IgY)是蛋雞受免疫刺激后，雞體內產生免疫應答，血液中免疫球蛋白G(IgG)被選擇性地轉移到卵黃中唯一的免疫球蛋白類[6]。與哺乳動物的IgG相比，雞蛋的IgY具有取材方便、提取方法比較簡單、產量高、穩定性較好等優點。可作為口服劑或飼料添加劑用于預防和治療動物早期的消化道疾病[7]。

我國豪豬的養殖尚處于起步階段,對豪豬的研究主要在繁殖、營養和生理等方面[8- 10]，有關豪豬疾病防治的研究報道較少。本研究以仔豪豬腹瀉大腸埃希菌為抗原，篩選獲得含有高效價抗豪豬大腸埃希菌卵黃抗體的免疫雞蛋的最佳條件，并在體外研究抗仔豪豬大腸埃希菌卵黃抗體對大腸埃希菌和沙門氏菌生長的抑制作用,從而為大量制備特異性卵黃抗體防治仔豪豬大腸埃希菌腹瀉病提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

純種桃源蛋雞，140日齡，購自桃源縣良種場。試驗期間試驗雞日常管理與衛生防疫按常規進行。

1.1.2 實驗菌株

仔豪豬腹瀉大腸埃希菌(E.coli)菌株和沙門氏菌(Salmonella)：常德職業技術學院農林工程系微生物實驗室自行分離鑒定，并傳代培養得到[11]。

1.1.3 主要試劑

牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、甲醛、三氯甲烷、硫酸銨(分析純)等，購自杭州微生物試劑有限公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑，購自北京鼎國昌盛生物有限責任公司；10號白油(食品級)、司班- 80、硬脂酸鋁、磷酸氫鈉(分析純)等，購自上海化學試劑總廠；卡拉膠，低甲氧基果膠和氯化鈣，購自天津市福辰化學試劑廠。

1.1.4 主要儀器

立式高壓蒸汽滅菌鍋，購自上海東亞壓力容器制造公司；分光光度計、生化培養箱、干燥箱，購自上海一恒科學儀器有限公司；電子天平，購自北京賽多利斯儀器有限公司；超凈臺，購自中國上海浦東物理光學儀器廠；醫用血球計數板，購自江蘇醫用電子儀器公司；注射器，購自成都市雙流雙陸醫療器械公司；冰箱，購自青島海爾公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基與免疫佐劑配制方法

牛肉膏蛋白胨培養基：按常規方法[12]制備，高壓滅菌，置4 ℃冰箱中保存，備用。

白油佐劑：取96 mL 的10號白油放入燒杯中，文火加熱，當溫度達160 ℃以上時，邊攪拌邊加入56 ℃水浴中預熱30 min的司班- 80 2 mL和硬脂酸鋁4 g，當后者完全溶解，混合液呈透明膠凍狀，小量分裝，高壓滅菌后4 ℃保存備用。

1.2.2 抗原制備

將仔豪豬腹瀉大腸埃希菌接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基，37 ℃培養24 h，用無菌0.01 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS，pH 7.2)，小心沖洗菌苔，調成濃度為1×1012mL-1菌液，再加甲醛溶液至終濃度為0.4%，37 ℃滅活24 h。在此過程中每隔2 h搖勻一次。滅活完畢4 ℃保存。

取滅活的大腸埃希菌液分別與等量佐劑混合乳化。當溶液乳化至滴在水面上呈“油包水”狀，即合格。否則繼續乳化。3種佐劑(完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和白油佐劑)與滅活菌的乳化制備方法相同。4 ℃保存。

1.2.3 產蛋雞免疫方案

桃源蛋雞分組，每組6只，分兩籠飼養。按照免疫抗原的不同劑量、不同佐劑種類和不同間隔時間等3種免疫強化方式分組。

不同劑量的免疫抗原：分3組，菌體濃度依次是1×1010、1×1012和1×1014mL-1。

不同佐劑依次是完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和10號白油3個組。

免疫強化方式分組，程序1：初免1次，無免疫強化。程序2：初免后每隔1 d免疫強化1次，連續4 次。程序3：初免后每隔2 d免疫強化1次，連續4 次。

1.2.4 高免卵黃抗體制備

收集未免疫雞蛋，初次免疫接種當天記為0 d，以后每隔7 d收集免疫蛋作樣本，依次編號記錄，4 ℃保存。連續收集9次。同時設未免疫對照組，注射PBS乳化劑。

先將收集的雞蛋用清水洗凈，再噴灑0.1%新潔爾滅消毒，無菌收集卵黃。分離卵黃與等量PBS混勻，然后加4倍體積的脫脂溶液[13](含0.06%的卡拉膠，0.18%的低甲氧基果膠和10 μmol·L-1氯化鈣)混勻，12 000 r·min-1、4 ℃離心25 min，取上清；再加硫酸銨至終濃度33%(m/V)，混勻，4 ℃ 1 h，12 000 r·min-1離心25 min，取沉淀用PBS溶解，加入硫酸銨至終濃度20%(m/V)，混勻，放于透析袋透析，無菌過濾后加0.01%硫柳汞和青鏈霉素1 000 IU·mL-1，小量分裝，-20 ℃保存。

1.2.5 蛋雞血清制備

免疫前1 d采血。免疫后每隔7 d，自雞翅靜脈采血1 mL。分離血清，3 500 r·min-1離心5 min除紅細胞。標記，置-20 ℃凍存。連續采血9次。

1.2.6 抗體效價測定

采用平板凝集試驗進行抗體效價測定。96孔“V”型微量血凝板中每孔加入滅菌生理鹽水25 μL，再吸抗體25 μL加入第1孔中，混勻，吸混合液25 μL于第2孔，混勻，吸混合液25 μL于第3孔。依次倍比稀釋至256倍(即第8孔，多余25 μL溶液吸棄)。留第9孔作空白對照，加滅菌生理鹽水25 μL。每孔加仔豪豬腹瀉E.coli抗原(含菌量為1×1012mL-1)25 μL，混勻各孔中溶液(每孔更換槍頭)，微量血凝板放振蕩器上震蕩，2～3 min后，記錄每孔凝集現象。對照孔溶液應為均勻渾濁。與對照孔中溶液一樣渾濁者判定為無凝集反應，記為-。凡是孔中溶液有肉眼可見絮狀凝集塊者，判定為有凝集反應，記錄為+。絮狀凝集塊愈多，陽性反應判定為愈強，分別用++、+++和++++表示。凡發生凝集反應結果判定為++的最高稀釋度即是該樣本抗體效價。效價用log2x(x為稀釋倍數)表示。

1.2.7 卵黃抗體的抑菌性檢測

以實驗室自行分離保存的致病性大腸埃希菌和沙門氏菌作為實驗菌株，進行體外抑菌性試驗，具體試驗操作參考文獻[14]進行，并稍加改進。取3只試管，每只內裝牛肉膏蛋白胨液體培養基8 mL。先在每個試管中加入大腸埃希菌指示菌懸液1 mL，再向其中2支試管各加入1 mL不同濃度的卵黃抗體，使卵黃抗體的最終濃度分別達到1 mg·mL-1和10 mg·mL-1。另外的1支試管中加入1 mL滅菌的生理鹽水作為陰性對照。同樣方法操作沙門氏菌。將6只試管放在37 ℃恒溫培養箱中培養，分別在1、5、8、21、25和29 h各取1 mL培養液，用分光光度計在600 nm波長下測定各個檢測樣本的吸光度D值。

2 結果與分析

2.1 免疫菌液濃度對卵黃抗體效價和雞血清抗體的影響

不同濃度(含菌數1×1010mL-1、1×1012mL-1和1×1014mL-1)的大腸桿菌懸浮液1 mL分別免疫蛋雞，無佐劑，經翅靜脈注射1次，免疫后特定時間收蛋和采血，測定卵黃抗體和血清抗體效價，結果如圖1中A和B所示。

圖1 抗原免疫菌液濃度對卵黃抗體(A)和雞血清抗體(B)效價的影響

從圖1中A看出，不同濃度菌液免疫的雞蛋，其卵黃抗體的效價有較大差異。1×1010mL-1菌量免疫的雞蛋卵黃抗體效價明顯低于1×1012mL-1和1×1014mL-1菌量免疫的雞蛋。但對1×1012mL-1和1×1014mL-1菌量免疫的雞蛋卵黃抗體效價差別不明顯。

從圖1中B和A對比可知，同等條件下，被免疫雞的血清抗體效價比卵黃抗體效價要略高一些。但就變化趨勢看，卵黃抗體效價與血清抗體效價的變化規律基本相同，均呈先上升，再平穩，后下降的趨勢，并且基本同步。因此，選擇注射菌液濃度1×1012mL-1的大腸桿菌懸浮液1 mL作為最佳免疫劑量。

2.2 不同免疫佐劑對卵黃抗體和雞血清抗體效價的影響

對蛋雞注射菌液濃度是1×1012mL-1菌懸浮液1 mL，添加不同佐劑(完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和10號白油)，經翅靜脈免疫注射1次，免疫后不同時間收蛋和采血測卵黃抗體和血清抗體效價。同時無佐劑免疫組同步免疫，作陰性對照。結果如圖2中A和B所示。

圖2 3種不同免疫佐劑對卵黃抗體(A)和雞血清抗體(B)效價的影響

圖2中A和B是3種免疫佐劑對卵黃抗體和雞血清抗體效價的影響。研究發現，佐劑的添加均可在一定程度上提高卵黃抗體和血清抗體的效價。但從3種佐劑產生的免疫應答看，完全弗氏佐劑效果最好，不完全弗氏佐劑和白油佐劑效果略差，后兩者對免疫應答的加強作用差異不明顯。添加完全弗氏佐劑后，可使第6周收集的免疫蛋卵黃抗體效價從3log2上升到5log2，同時第6周采集的血清抗體效價從4log2上升至7log2，增加幅度明顯。因此在制備免疫原時選擇大腸埃希菌懸液與完全弗氏佐劑等量混合。

2.3 不同強化免疫程序對卵黃抗體和雞血清抗體效價的影響

給蛋雞免疫濃度是1×1012mL-1菌懸液1 mL，添加等量完全弗氏佐劑，經翅靜脈注射，不同程序強化免疫，免疫后不同時間收蛋和采血，測卵黃抗體和血清抗體效價，結果如圖3中A和B所示。

圖3中A和B是不同強化免疫程序對卵黃抗體和血清抗體效價的影響。結果顯示，與未進行免疫強化的程序1相比，兩種免疫強化的程序2和3均可明顯提高卵黃抗體和血清抗體效價。重要的是，在未進行免疫強化的雞血清和卵黃中，其抗體效價分別在第8周和第9周明顯下降，但免疫強化后，下降趨勢或者被推遲出現或者被完全消除。對比3種免疫程序，發現程序2和3在效果上差異不明顯，因此，為節約時間，可選擇采用免疫強化程序2對蛋雞免疫。

2.4 卵黃抗體的活性測定

2.4.1 卵黃抗體對大腸埃希菌的抑菌性測定結果

制備的卵黃抗體對大腸埃希菌在生長的早期具有明顯的抑制作用,試驗組和生理鹽水對照組的D值具有明顯差異,但是在24 h以后，卵黃抗體對大腸埃希菌的抑制作用下降。結果見圖4中A。

2.4.2 卵黃抗體對沙門氏菌的抑菌性測定結果

制備的卵黃抗體對沙門氏菌在生長的過程中具有一定的抑制作用,但是較大腸桿菌小。結果見圖4中B。

圖3 免疫程序對卵黃抗體(A)和雞血清抗體(B)效價的影響

圖4 不同濃度的卵黃抗體對大腸埃希菌(A)和沙門氏桿菌(B)的抑菌作用

3 討論

免疫蛋的制備，實質上是對蛋雞進行抗原免疫，讓其在血液中產生的抗體轉化到蛋黃中貯藏而形成含有較高特異性抗體濃度的雞蛋。研究顯示，抗原進入機體要經過一個潛伏期才開始發生免疫作用，細菌抗原多是5～7 d。本研究結果表明，免疫初期，免疫組與對照組卵黃抗體效價和血清抗體效價均無明顯差別，說明是處在免疫潛伏階段。

動物在受到抗原刺激后，在免疫應答不同階段所產生的抗體類別是有差異的。初次應答所產生的抗體水平不高，IgG很少，多數為IgM。但免疫加強后，抗體效價增高迅速，產生抗體則主要為IgG，而IgM很少。此現象的原因是記憶細胞開始重新分化、增殖，產生大量抗體。本文研究也印證了這一點，在免疫加強后，卵黃抗體和血清抗體效價均有大幅度升高現象。

以仔豪豬大腸埃希菌懸浮液對140日齡純種桃源蛋雞免疫時，若固定免疫抗原劑量為1 mL，則當菌液濃度低于1×1012mL-1時，免疫應答強度隨免疫劑量的降低而降低；當菌液濃度高于1×1012mL-1時，免疫應答強度則不會隨免疫劑量的增加而得到明顯增強。據此確定免疫菌液濃度是1×1012mL-1，劑量定為每次1 mL。在菌懸液中分別添加等量完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和10號白油佐劑免疫蛋雞時，均可明顯加強雞體免疫應答強度，其中完全弗氏佐劑對免疫應答加強的程度最高，且對受試動物無不良作用。初免后，每隔1 d強化免疫1次，連續4次的強化免疫程序既經濟又有效。

體外抑菌性作用的試驗結果表明，制備的卵黃抗體對大腸桿菌在生長的早期具有明顯的抑制作用，試驗組和生理鹽水對照組的D值具有明顯差異，但是在24 h以后，卵黃抗體對大腸桿菌的抑制作用下降。對沙門氏菌在生長的過程中具有一定的抑制作用,但是作用不是非常明顯。

本文研究了仔豪豬腹瀉大腸埃希菌高免卵黃抗體及免疫雞血清抗體的變化規律，制備出了高效價的卵黃抗體和血清抗體。免疫后高效價卵黃抗體可以維持4周以上。試驗結果為臨床應用雞源高效卵黃抗體防治仔豪豬大腸埃希菌腹瀉病研究提供了技術依據和實驗材料。

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(責任編輯：盧福莊)

2016- 12- 18

國家星火計劃項目“桃源豪豬健康養殖示范推廣及產業化開發”(2015GA770010);湖南省教育廳科學研究項目(12C0974;14C0805); 湖南省常德市科技計劃(2012CK03、2011CK01);湖南文理學院生科學院2016年省級平臺開放科研項目(SKYPT201607)

張保平(1978—)，男，內蒙古人，講師，碩士，從事預防獸醫學研究工作，E- mail：bpzhang2007@126.com。

李 娜(1977—)，女，講師，碩士，從事動物病原微生物與免疫學研究工作，E- mail：vetlina@126.com。

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170339

S858.9；S852.4

A

0528- 9017(2017)03- 0484- 05

文獻著錄格式：張保平，李娜，高惠林，等. 抗豪豬大腸埃希菌卵黃抗體的制備及抑菌性研究[J].浙江農業科學，2017，58(3)：484- 488.