免疫分析技術在獸藥殘留檢測中的應用

趙 蕓，張 樂，柳愛春

(杭州市農業科學研究院 實驗中心，浙江 杭州 310024)

免疫分析技術在獸藥殘留檢測中的應用

趙 蕓，張 樂，柳愛春

(杭州市農業科學研究院 實驗中心，浙江 杭州 310024)

食品中的獸藥殘留物，如抗生素、驅腸蟲劑、β- 受體興奮劑和類固醇等對消費者的健康有極大危害。免疫分析法能對大量不同化合物進行篩查，該方法快速、靈敏，且效益高，已經被廣泛應用于篩查各種獸藥殘留，可以顯著減少常規分析的取樣需求量。該文綜述了用于獸藥殘留檢測的免疫分析技術的常見方法、基本原理與應用。

免疫分析； 抗體； 獸藥殘留

為了提高動物的生產量，大量的化學合成物被做為獸藥用于動物治療或診斷。常用的獸藥包括治療細菌感染的抗生素，從動物體內排出寄生蟲的驅腸蟲劑、β- 興奮劑，以及生長促進劑類固醇激素。雖然大部分獸藥都沒有強烈毒性，但獸藥殘留物對動物和人體健康有害[1]。在許多發達國家，一些化合物由于具有潛在的致癌性已經被禁止，例如：硝基呋喃類、己烯雌酚、氯霉素；另一些如抗生素類在動物中的最大殘留量也有極為嚴格的規定，以盡量減少藥物殘留對食品造成的不良影響[2]。可食用產品中出現有害殘留物，可能是非法使用藥物或未能遵守動物屠宰之前的停藥期而造成的。因此，監測飼料與食品中獸藥的技術至關重要，可以進一步保護人類和動物的健康，減少化合物對消費者的影響并降低藥物對環境的影響。

到目前為止，仍然是根據獸藥的物理和化學性質，通過化學方法監測獸藥。用于檢測獸藥的分析方法包括微生物學分析法、高效液相層析(HPLC)法、氣相層析(GC)法以及毛細管區帶電泳法等。對樣品作進一步調查的驗證測試，一般是以質譜(MS)分析法為基礎的[3]，例如LC- MS與LC- MS/MS。這些分析技術往往價格昂貴而且耗費勞力，通常只對有限數量的樣品進行檢測。近幾年，快速篩查試驗樣品的需求不斷增長，進一步催生了新的分析方法免疫分析技術[4]。

1 免疫分析技術的基本原理

免疫分析法是指利用抗原抗體特異性結合反應來檢測各種物質(藥物、激素、蛋白質、微生物等)的分析方法，已經被廣泛應用于對大量化合物的檢測。其主要優點是價格便宜、快速、簡單，適合于高通量篩查。此外，它們并不需要高科技設備或專門的操作人員，被認為是用于現場監測方案的最適合的技術。常用的免疫分析法有酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、膠體金免疫測定法(GICA)、量子點熒光免疫分析法(QIA)、熒光偏振免疫分析法(FPIA)、化學發光免疫分析法(CLIA)、電化學免疫分析法(EIA)以及免疫傳感器與微陣列技術等。免疫分析法的建立是以一種抗原與一種抗體的交互作用為基礎的，即抗原決定簇與抗體連接位點的反應。抗原涉及多聚物，如蛋白質、多肽、多糖或核蛋白，它們刺激免疫響應，并且與免疫的生成物(例如抗體)結合在一起。盡管存在不同的測試類型，然而所有的免疫分析法都是基于相似的原理(圖1)。分析物樣品(溶液或基質)與抗體一起培養，通過抗原發生結合反應，形成了分析物- 抗體復合物。然后，可以直接或間接地通過示蹤劑進行標記和測定。大部分用于檢測獸藥殘留的免疫分析法都屬于此種類型。通過標記抗原或抗體，可以提高免疫分析方法的靈敏度，這種標記可以是放射性的、熒光的或化學的發光物。

圖1 免疫分析法的基本步驟與原理

2 免疫分析技術的常見種類及應用

2.1 ELISA

用于ELISA測試，標記物一般是辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶、丙酮酸脫氫酶以及重組的β- 半乳糖苷酶[5- 6]。這些酶促反應往往會導致基質降解，形成有色的生成物，然后借助分光光度計，檢測這些有色生成物。

Liu等[7]采用陽離子牛血清白蛋白(BSA)的免疫原與氯丙嗪綴合，制備了一種針對氯丙嗪的單克隆抗體，并且開發出一種間接式對抗型的ELISA分析方法，用于檢測雞肝與豬肝中的氯丙嗪。這種抗體對氯丙嗪的靈敏度高，其IC50平均值為0.73 μg·L-1，且檢測數據穩定。Liu等[8]制備了針對達氟沙星的抗體，并且創建了一種對抗型的ELISA分析法，用于監測雞肝中的達氟沙星；其IC50為2.0 μg·L-1，檢測下限為0.8 μg·L-1，該檢測結果與LC/MS分析法的檢測結果一致。與此類似，科學家們也制成了針對加替沙星與培氟沙星的抗體[9]，分別用于檢測雞肝與牛奶中的加替沙星與培氟沙星。近些年，ELISA分析法已被廣泛用于檢測不同基質中的獸藥，包括四環素[10]、羥氨芐青霉素[11]、呋喃唑酮[12- 14]、呋喃妥因[15]、磺胺[16- 17]以及己烷雌酚[18]。

另外，通過與生物素- 鏈霉親和素體系結合，經典的ELISA分析法的靈敏度得到明顯改善。這種體系是以生物素與鏈酶親和素的高特異性和強親和力為基礎的，它可以使更多的酶催化基質。Wang等[19]通過生物素- 鏈霉親和素ELISA分析法，測定牛奶中的氯霉素殘留物，其檢測下限是0.042 ng·g-1，其靈敏度是傳統對抗型ELISA的8倍。

ELISA也可以對在各種基質中的多種獸藥殘留物進行多重分析。Zhang等[17]開發了一種直接式對抗型的ELISA分析法，用來檢測豬肉、雞肉、魚以及蛋提取物中的7種磺胺殘留物。Cháfer- Pericás等[16]開發了一種間接式對抗型的ELISA分析法，用來檢測魚樣品中的3種磺胺殘留物——磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲氧嗪、磺胺嘧啶。這些抗菌藥的檢測極限(LOD)低于100 ng·g-1。

2.2 QIA

對蛋白質生物標記物的靈敏定量檢測是免疫分析法設計的關鍵。目前已開發出信號放大的各種方法，諸如以量子點(QDs)為基礎的分析方法。量子點屬于一種新的發光熒光團，優于多種傳統的熒光染料。與有機熒光團相比，量子點表現出更為顯著的亮度與光穩定性以及超強的生物兼容性[20]。Chen等[21]開發了一種間接式以量子點為基礎的熒光免疫分析法，用于檢測雞肉中的恩諾沙星，以量子點為基礎的QIA的IC50值可以達到8.3 ng·g-1。

量子點具有窄的發射與寬的激勵光譜，這意味著它有可能用一種單一的激勵激光波長來激勵不同的量子點。此外，通過改變納米晶體的尺寸與材料類型，量子點的發光顏色可以不同。因此，對抗生素分析而言，可以實現多重分析物檢測。Peng等[22]已開發出一種多重熒光免疫分析法，通過制備生物素變性的牛血清白蛋白(Bt- dBSA)涂覆的碲化鎘(CdTe)量子點綴合物，同時對3種獸藥進行檢測。3種抗體分別與3種不同的量子點綴合，在1塊微孔板的1個孔井內對2種化合物進行檢測。這種方法的LOD值分別為0.16、0.06與0.14 ng·g-1。另外，也有學者使用量子點作為熒光標記對磺胺二甲嘧啶殘留物進行檢測，把量子點納米晶體與對磺胺二甲嘧啶的單克隆抗體(MAb)耦合[23]，或者把量子點納米晶體與二級抗體耦合[24]，測定雞肉或牛奶中的磺胺二甲嘧啶殘留物，其IC50平均值分別為7.7與4.3 ng·g-1。

2.3 GICA

大多數免疫分析通常都是在實驗室進行的，因此，在產品被商業化之前需要很長的時間；然而，人們對食品鏈始端進行現場監控的要求日益迫切。使用檢測試紙可對獸藥進行快速檢測(圖2)[25]。在檢測試紙條中，目前發展最成熟和最常用的膠體金試紙條，采用膠體金免疫層析技術研制而成，以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲透，通過抗原抗體結合，并利用膠體金呈現顏色反應，檢測抗原抗體。其基本原理參見圖2。

圖2 膠體金試紙條的結構與原理

Zhu等[26]利用快速而靈敏的膠體金免疫層析法檢測試條，檢測雞肉與肝臟中的12種喹諾酮類。被檢測的氟喹諾酮與用于金標記抗體的膜片上結合的抗原對抗，當在膜片上不再有游離的金標記抗體時，試驗線消失，但控制線始終出現。對于被污染的雞肉與肝臟中檢測到的氟喹諾酮，LOD值低于50 ng·g-1。從樣品制備到檢測，整個過程可以在10 min內完成。

2.4 免疫傳感器及微陣列芯片技術

常見的免疫傳感器有2種：一種是以酶為基礎的生物傳感器，其檢測信號是通過一種綴合酶(如酪氨酸酶和乙酰膽堿酯酶)的抑制所提供的；另一種是光學表面等離子體共振(SPR)生物傳感器[27- 28]。SPR是一項流通型生物傳感器技術，當物質被結合到金屬表面上時，SPR可以測量金屬表面折射率產生的微小變化。

Crooks等[29]開發了一種快速免疫分析法，使用1種光學生物傳感器檢測豬膽汁中的磺胺二甲嘧啶。Samsonova等[30]探討了檢測牛肝中抗寄生蟲藥伊維菌素的生物傳感器免疫分析法，采用的傳感器是以SPR為基礎的Biacore光學儀器，檢測下限達19.1 ng·g-1；肝臟樣本水平增加到100(伊維菌素的最大殘留量極限)與50 ng·g-1時，IC50平均值分別為93.7、43.2 ng·g-1。Haughey等[31]開發了一種用于檢測克倫特羅的生物傳感器分析法，該方法以抑制原理為基礎，在分析物抗體結合到固定在傳感器芯片表面的藥物時，對分析物抗體進行檢測，樣品中克倫特羅的量越高，抑制的水平將會越高。Thompson等[32]開發了一種生物傳感器分析法，用于對豬、牛、綿羊的腎，禽類的肝，血清、雞蛋和牛奶中的硝基咪唑化合物進行多重殘留物的篩查；來自于20個峰值樣品的分析結果顯示，這種方法對所有樣本中的二甲硝基咪唑的檢測能力小于1 ng·g-1。

微陣列芯片技術是以檢測系統為基礎的陣列，以固定在不同表面的小分子或蛋白質作為試樣，可適于各種篩查。微陣列已經被廣泛用于執行高通量藥物殘留物篩查[33- 34]。Zhong等[35]開發了一種蛋白質微陣列免疫分析法，用于檢測雞肉中的克倫特羅與磺胺二甲嘧啶，克倫特羅的IC50為39.6 ng·g-1，磺胺二甲嘧啶的IC50為48.8 ng·g-1；傳統的ELISA分析，相應的IC50分別為190.7與156.7 ng·g-1；Rebe等[36]利用SPR系統生物傳感器結合微陣列檢測慶大霉素和新霉素，相應的IC50分別為8與21 ng·g-1，靈敏度較高。Peng等[37]創建了一種小分子的微陣列檢測方法，可同時檢測食品中的氯霉素、克倫特羅與泰樂菌素，每種分析物的校正曲線均顯示出較高的靈敏度，氯霉素、克倫特羅、泰樂菌素的IC50分別為0.14、0.53、10.53 ng·g-1。

3 小結

越來越多的研究表明，免疫分析法是用于檢測藥物殘留的一種可靠工具，該方法可以在短時間內以較低的成本篩查大量的樣品。免疫分析法是對常規分析方法的強有力補充，然而，還有以下幾個方面仍值得進一步注意：首先，許多可供利用的檢測分析方案尚未被權威監管部門確認。這種以免疫分析法為基礎的獸藥殘留檢測方案被用于定量的目的而取代經典檢測方法時，權威監管部門對新檢測方法的認可是必需的[38]。商戶、廠家、用戶以及監管機構如果共同展示，并證明免疫分析方法的質量與有效性，這些方法就可以得到有效的推廣。其次，還需要進一步開發穩定的免疫試劑(如新的示蹤劑等)，以避免由于穩定性、成本、處理和存儲等原因而造成不利后果。最后，生產者在實踐過程中采用一些新的策略思路，生產靈敏度與選擇性更高的抗體，也是一種有效的途徑。

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(責任編輯：侯春曉)

2016- 09- 27

杭州市重大科技創新項目

趙 蕓(1969—)，女，浙江杭州人，研究方向為農產品加工與檢測技術研究，E- mail:fxpbio@163.com。

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170340

S859.84

B

0528- 9017(2017)03- 0489- 04

文獻著錄格式：趙蕓，張樂，柳愛春. 免疫分析技術在獸藥殘留檢測中的應用[J].浙江農業科學，2017，58(3)：489- 492，496.