慢性應激后小鼠空間學習記憶功能及腦內BDNF表達的變化

吳晨　趙曉東　宦冉　孫麗娟　單潔　李亞

【摘 要】目的：研究慢性應激后小鼠海馬和前腦皮層BDNF表達的變化，探討小鼠學習記憶功能變化的機制。方法：建立多因素慢性應激小鼠模型，通過Morris水迷宮檢測小鼠空間學習記憶能力；免疫組織化學方法檢測小鼠海馬和前腦皮層BDNF表達水平的時序變化。結果：與對照組小鼠比較，慢性應激后即刻和24h組小鼠在水迷宮中的空間學習記憶能力明顯減退（P<0.05， P<0.01），海馬CA1、CA3、DG和前腦皮層BDNF的表達明顯減少（P<0.05，P<0.01）；而慢性應激后一周組小鼠的學習記憶能力有部分恢復，海馬各區和前腦皮層BDNF的表達亦有所增加，無顯著性差異。結論：BDNF在海馬和前腦皮層表達的下調，可能與慢性應激后小鼠學習記憶功能的損傷有關。

【關鍵詞】慢性應激；學習記憶；BDNF；海馬；前腦皮層

【Abstract】Objective：To explore the mechanism of learning-memory function alteration in mice after chronic stress， and the expressions of brain derived neurotrophic factor（BDNF） of prefrontal cortex （PFC） and hippocampus （HP） in mice.Methods：The chronic stress mice model was established by using multiple chronic unpredictable stressors.The abilities of learning-memory were measured using Morris water maze task.The expression of BDNF in PFC and HP were tested by immunohistochemical method.Result：The spatial learning-memory function in mice were significantly decreased （P<0.05， P<0.01） in immediately and 24h after stress groups， compared with control group mice.Meanwhile，the expression of BDNF in the CA1，CA3，DG of HP and PFC were significantly reduced （P<0.05，P<0.01）.A week after stress， the spatial learning-memory function in mice was partly enhanced，the expression of BDNF in HP and PFC were partly increased，and there was no significant difference.Conclusion：The impairment of learning-memory function induced by chronic stress in mice，which may be nearly associated with the down-regulated expression of BDNF.

【Key words】Chronic stress；Learning and memory；BDNF；Hippocampus；Prefrontal cortex

研究證實，長期的慢性應激狀態，可引起機體內穩態失衡，腦內出現產生廣泛的神經化學及形態學改變，動物的行為和學習記憶功能明顯減退[1]。已有許多研究報道，海馬和前額葉皮層是學習記憶信息儲存和整合的關鍵腦區，并且在機體應激反應的調控中也具有重要作用。研究發現，慢性應激可引起海馬神經元形態結構發生變化和丟失、亦可引起前額葉皮層體積變小、樹突萎縮及神經元丟失等變化[2]，進而影響海馬和前額葉皮層的功能。腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）屬于神經營養因子家族的重要成員之一。研究報道，BDNF是中樞神經系統中分布最廣、含量最高的神經營養因子，特別是海馬、杏仁核、紋狀體和皮層等部位都有豐富的表達，對神經細胞具有營養、支持和保護作用。BDNF可增強動物腦內神經細胞間的突觸聯系，從而使學習記憶功能增強[3]。本研究建立多因素慢性應激動物模型，檢測慢性應激后小鼠學習記憶功能的變化，并且測定小鼠海馬和前腦皮層神經元BDNF表達的動態變化，探討BDNF在慢性應激所致小鼠學習記憶功能變化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

昆明種3月齡健康小白鼠，SPF級，體重22±2g，雌雄各半，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK（魯）20140007。實驗小鼠在實驗室適應一周。自由飲水進食。隨機分為對照組和慢性應激組。

1.2 慢性應激動物模型制備

慢性應激組小鼠采用7種不同應激源，實驗周期28天。為高臺（高1.6m，直徑0.05m，1h/次）、足底電擊（電壓36V，15秒/次，每次間隔1分鐘，共30次）、通宵照明（10h）、冰水游泳（8oC冷水中游泳，3min）、禁食（36h）、禁水（24h）、斜籠擁擠（36h）。每天隨機給予一種刺激；對照組小鼠在相同飼養環境中正常飼養，不接受任何實驗應激源刺激。在慢性應激后即刻、應激后24h及一周進行水迷宮實驗和BDNF檢測。

1.3 Morris水迷宮檢測學習記憶能力

采用Morris水迷宮進行兩組小鼠的學習記憶能力檢測。Morris 水迷宮為一圓形水池（直徑80cm，高50cm），水溫控制在25±1℃。水迷宮被均等分為四個象限，在第一象限（目標象限）水面下1cm放置一塑料平臺，在其對面第三象限池壁中間位置放置一明顯標記物。測試程序包括定位航行和空間搜索兩部分。檢測歷時3天，其中前2天為定位航行，將小鼠分別從水迷宮的四個象限中心位置面向池壁輕輕放入水中，記錄小鼠找到平臺所需要的時間，即逃避潛伏期（Escape latency）。第3天為空間搜索試驗，撤掉平臺，將小鼠在第三象限池壁的中心點放入水中，記錄小鼠在各個象限的游泳時間，總時間上限為120s。檢測小鼠對平臺（目標象限）的記憶能力。

1.4 小鼠海馬和前腦皮層BDNF的表達

小鼠腹腔注射0.4%的戊巴比妥鈉麻醉，暴露心臟，經心先灌注生理鹽水，再以事先冰上預冷的多聚甲醛溶液（4%）灌注，完整取腦；置于固定液中后固定，梯度酒精脫水、透明和石蠟包埋，對腦組織進行連續冠狀切片（片厚5μm）。采用SABC（鏈霉素過氧化復合物）免疫組織化學試劑盒，DAB顯色劑進行免疫組化染色，BDNF多克隆抗體，購于武漢博士德生物工程有限公司。以PBS（磷酸鹽緩沖液）代替一抗作陰性對照。采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析處理系統，分析計算海馬CA1、CA3區、齒狀回（DG）和前腦皮層（PFC）BDNF陽性神經元的數目。

1.5 統計學處理

數據均以平均數±標準差（M±s）來表示，逃避潛伏期采用重復測量方差分析（repeated-measures ANOVA）；各象限游泳時間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較以LSD法分析。其他數據組間比較用非配對t 檢驗分析。P<0.05 時說明有統計學差異。

2 結果

2.1 慢性應激后小鼠空間學習記憶功能的變化

統計學分析結果顯示（表1），在定位航行中，兩組小鼠隨訓練周期其逃避潛伏期均顯著降低（對照組F=9.638，P<0.01；應激后即刻F= 6.366，P<0.01）。與對照組比較，應激后即刻、24h和應激后一周小鼠的逃避潛伏期均長于對照組小鼠（P<0.05，P<0.01）。

2.2 慢性應激后小鼠海馬和前腦皮層BDNF的表達

小鼠免疫組化結果（表3），與對照組比較，在應激后即刻應激組小鼠PFC和海馬CA1、CA3、DG區BDNF陽性神經元數目顯著減少（P<0.05，P<0.01）；在應激后24h，僅在PFC和海馬CA1、DG區BDNF陽性神經元數目明顯減少（P<0.05）；而應激后一周則無顯著性差異（P>0.05）。結果表明，慢性應激后小鼠海馬和前腦皮層BDNF的表達減少，應激后一周有部分恢復。

3 討論

本研究結果顯示，慢性應激能夠在一定程度上損傷小鼠的空間學習記憶。有研究報道，多因素的慢性應激可引起前額葉皮層和海馬的選擇性損傷，從而導致動物學習記憶障礙、癡呆、抑郁等[1]。已經明確，海馬和前額葉皮層功能最復雜的腦區之一，在空間學習記憶、情緒、工作記憶以及行為計劃和組織等方面具有重要作用，同時也是參與應激反應的重要腦區。慢性應激后，可引起海馬神經元突觸可塑性發生改變，空間學習記憶損傷[4]。研究報道，在不同應激刺激狀態下，可引起動物的工作記憶功能明顯受損[5]。BDNF是神經營養因子家族的重要成員。有研究報道，BDNF能維持成熟神經細胞的生存、生長、分化和凋亡，促進神經細胞的修復和再生[6]，增加神經細胞間的突觸聯系，能有效防止神經元的變性及死亡[7]。研究表明，BDNF廣泛參與動物的學習記憶等認知功能，在神經元可塑性的調控中具有重要作用[3]。研究報道，BDNF mRNA高表達區在海馬、上丘和內側前額葉皮層，并且在海馬內其表達量最豐富[8]。本實驗室早先的研究顯示，慢性應激后，小鼠出現抑郁樣行為以及空間學習記憶能力顯著降低，并且海馬各區及前腦皮層BDNF表達降低[9]。在本研究中，慢性應激引起小鼠水迷宮空間學習記憶能力明顯減退，腦內海馬各區和前腦皮層BDNF的表達顯著降低，但慢性應激后各項指標有部分恢復。結果提示，海馬及前腦皮層神經元BDNF表達的下調，可能參與了慢性應激后小鼠空間學習記憶功能的損傷機制。

【參考文獻】

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[責任編輯：田吉捷]