基于CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術研究進展

尹暢

【摘 要】CRISPR/Cas9 是最近發現的一種新型的基因組定點編輯技術。該系統為細菌與古細菌中抵御外源病毒和質粒DNA入侵的獲得性免疫機制系統，與TALEN和ZFN 技術設計相比更加簡單、更容易操作，目前，該技術已成功應用于人類細胞、細菌、斑馬魚、豬、小鼠、食蟹猴以及多種植物的基因組精確修飾，是最具有臨床與應用前景的基因治療技術之一。

【關鍵詞】基因編輯；CRISPR/Cas9系統

早在1987 年，CRISPR序列由日本科學家在大腸桿菌中發現[1]，但由于這段序列的功能無法確定，因此該發現一直未引起人們的注意，隨后，研究人員研究發現這種間隔重復序列廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中，隨著人們對該結構的逐漸了解，2002 年，這種結構被正式定義為CRISPR。2005 年，研究人員發現CRISPR的間隔序列可以識別并結合特定的噬菌體DNA 序列，從而使得CRISPR序列在獲得性免疫中發揮作用。2008 年，Marraffini 等[2]發現細菌CRISPR 系統能夠阻止外源質粒的轉移，并首次利用實驗驗證了CRISPR 系統的功能，科學家們也由此揭開了研究CRISPR 系統作用機制的序幕。

1 CRISPR的結構與分類

CRISPR 作為一種特殊DNA 重復序列，主要由多段長度為25 50 bp 長度的高度保守重復序列和26 72 bp 長度的間隔序列串聯而成。同一個CRISPR位點中的重復序列一般具有極高的保守性，5端與3端部分尤為保守，但在微生物種間甚至同一個基因組的不同CRISPR位點間卻存在較大的差異。另外，不同的CRISPR位點，其包含的間隔序列的數量差別也很大，從幾個到幾百個不等。

CRISPR/Cas 系統大體上可以分為3大類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅰ型和Ⅲ型在介導外源DNA 降解過程中需要多種Cas 蛋白來參與反應，形成的切割復合體結構復雜，Ⅱ型系統組分則較為簡單，只需要一個Cas9 蛋白來切割DNA 雙鏈。一個簡易的Ⅱ型CRISPR/Cas 系統必定要含有gRNA 和Cas9，Cas9 蛋白具有改造crRNA 和破壞雙鏈DNA 的雙重功能，位于gRNA 5' 端的20 bp左右的堿基決定CRISPR/Cas9 系統在應用時Cas9核酸酶特異性切割的位點，主要負責決定CRISPR/Cas9 系統的特異性。目前以Ⅱ型CRISPR 系統為基礎的CRISPR/Cas9 系統在基因組編輯中有較為廣泛的應用。

2 CRISPR/Cas9的作用機理

CRISPR/Cas9 基因組編輯技術的基本原理為，將tracrRNA： crRNA 設計為引導RNA（gRNA），gRNA 包含位于5端靶DNA 的互補序列以及位于3端tracrRNA： crRNA 的類似序列，利用靶DNA 的互補序列來定位需要編輯的位點，利用該類似序列與Cas9進行結合。該技術僅設計引導RNA 即可實現對含有PAM 序列的任一靶DNA序列進行插入、敲除與定點突變等修飾。由于設計操作簡單、通用性好及編輯效率高等優勢，CRISPR/Cas9 的基因編輯技術已成為TALEN 與ZFN之后的新一代基因組編輯技術。

另外，CRISPR/Cas9 系統還可以實現同時對多個不同靶DNA 序列進行編輯。利用CRISPR 位點自身的特點，設計對應不同靶DNA 序列的間隔序列，插入到重復序列之間，經過轉錄加工后會形成多個可定位于不同靶DNA 序列的雙引導RNA，或者串聯不同的sgRNA均可實現對哺乳動物細胞基因組的多個不同基因同時進行編輯。

3 CRISPR技術的應用

CRISPR/Cas9 系統作為新興的基因編輯技術，目前已逐步在人類細胞、斑馬魚、小鼠、酵母、果蠅、細菌及水稻等作物中進行研究并報道。

在作物新品種培育和改造時，傳統的轉基因技術培育和改造新品種一般采用利用外源基因隨機整合的方式，轉基因表達的可控性較差。而CRISPR/Cas9 技術則可以進行定點修飾，達到高效定向。Shan 等用該技術敲掉了小麥的一個基因，得到了耐白粉病的小麥新品種。該團隊還利用CRISPR/Cas9 技術定點突變了小麥和水稻兩種作物的MLO 和PDS 等5 個基因。

在哺乳動物的研究方面，研究人員采用該技術建立基因打靶小鼠，結果證實，采用該技術不僅可以通過非同源末端連接途徑實現對多個靶基因的定點敲除，還可以通過同源重組途徑對多個靶基因進行靶向修飾。這些成果為其在生物工程、基礎醫學、醫藥學科等多種領域中的應用中提供了有力的基礎。

4 展望

CRISPR/Cas9 作為細菌最為簡單的Ⅱ型獲得性免疫系統，被成功改造為繼TALEN 與ZFN 之后新一代基因組編輯技術，為基因組的定向改造調控與應用等帶來突破性革命，且相對于TALEN 和ZFN，CRISPR/Cas9有其獨特的優勢：（1）構建和設計方法簡單快捷，成本低廉，適用于任何分子生物實驗室；（2）用于基因組的點突變編輯效率優于ZFN和TALEN；（3）可同時實現多個基因的打靶。可見，CRISPR/Cas9 在基礎理論研究、農牧漁業和臨床治療等領域必將有越來越廣闊的應用前景。當然，目前關于CRISPR/Cas9 系統還有許多亟待解決的問題，相信隨著人們逐步深入和全面的研究，CRISPR/Cas9 技術將會展現出其無比強大的生命力。

【參考文獻】

[1]Ishino Y， Shinagawa H， Makino K， et al. Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product [J]. J Bacteriol， 1987， 169（12）：5429-5433.

[2]Marraffini L A， Sontheimer E J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science，2008，322（5909）：1843-1845.

[責任編輯：朱麗娜]