組蛋白乙酰化修飾對瘦素誘導的乳腺癌MDA-MB-231細胞生長的影響

周偉強

（沈陽醫學院基礎醫學院，遼寧省環境污染與微生態重點實驗室，遼寧 沈陽 110034）

組蛋白乙酰化修飾對瘦素誘導的乳腺癌MDA-MB-231細胞生長的影響

周偉強

（沈陽醫學院基礎醫學院，遼寧省環境污染與微生態重點實驗室，遼寧 沈陽 110034）

目的：研究組蛋白乙酰化修飾對瘦素誘導的乳腺癌MDA-MB-231細胞生長的影響。方法：采用實時定量PCR、Western blot法測定瘦素和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑SAHA對乳腺癌MDA-MB-231細胞生長的影響。應用染色質免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）技術了解瘦素和SAHA影響組蛋白乙酰化水平的程度。結果：瘦素與乳腺癌MDA-MB-231細胞作用后HDAC1的mRNA和蛋白表達明顯增強，并伴有組蛋白H3、H4乙酰化水平降低（P＜0.05）。ChIP結果顯示瘦素處理的乳腺癌細胞p21WAF/CIP1啟動子區域與乙酰化組蛋白H3、H4結合的染色質物質明顯少于未處理細胞組的相同區域（P＜0.05）。結論：瘦素誘導乳腺癌細胞增殖過程中伴隨組蛋白乙酰化水平的變化，通過激活HDAC的活性使核心組蛋白去乙酰化，從而抑制p21WAF/CIP1的表達，最終促進細胞周期從G1→S期的進程。

乳腺癌；MDA-MB-231；SAHA；去乙酰化

在臨床上，雌激素受體（estrogen receptor，ER）作為用于評估激素依賴性、預測內分泌治療效果的分子標志物，是乳腺癌一個重要的預前和預后因子［1］。然而大約10%～20%乳腺癌患者呈ER陰性，以惡性程度高、侵襲性強、化療敏感及預后差為主要特征，是目前乳腺癌治療的難點之一［2-3］。研究顯示，在乳腺細胞功能異常時，組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的活性明顯增強，因此抑制HDAC活性可能逆轉乳腺癌的發生和發展［4］。組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）屬于羥肟酸類廣譜的HDAC抑制劑，通過抑制HDAC活性，誘導靶細胞中組蛋白高度乙酰化，啟動某些特異性基因的表達而達到阻斷腫瘤生長的目的。研究表明，SAHA可誘導MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、SKBr-3等乳腺癌細胞凋亡的產生［5-6］。同時前期研究采用細胞劃痕、Transwell細胞侵襲力測定等方法研究瘦素（Leptin）對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲力的影響，結果發現Leptin可顯著增強乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移力及侵襲力［7］。因此，本研究選取ER陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞，研究HDAC抑制劑SAHA和Leptin聯合使用后對MDA-MB-231細胞產生的影響，同時闡明Leptin誘導乳腺癌細胞生長與SAHA抗腫瘤效應之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231由本實驗室凍存；Leibovitz's L-15培養基、胎牛血清、青霉素及鏈霉素購自美國Thermo公司；人重組Leptin蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；EZ染色質免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）試劑盒購自美國Millipore公司；HRP標記的兔抗羊多克隆抗體和羊抗β-actin抗體購自美國Abcam公司；羊抗HDAC1單克隆抗體、羊抗乙酰化組蛋白H4多克隆抗體、羊抗組蛋白H4多克隆抗體、羊抗乙酰化組蛋白H3多克隆抗體、羊抗組蛋白H3多克隆抗體、羊抗p21WAF1/CIP1多克隆抗體等購自美國Millipore公司；SAHA及其它化學試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人乳腺癌MDA-MB-231細胞培養于含15%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的鏈霉素的Leibovitz's L-15培養基中。

1.2.2 全細胞RNA提取和實時定量PCR 將5× 105/ml乳腺癌MDA-MB-231細胞接種于6板各孔中，細胞進行無血清同步化處理后加入0.625 nmol/L Leptin和5 μmol/L SAHA與MDA-MB-231細胞孵育32 h。將與Leptin、SAHA處理過的乳腺癌細胞洗脫、離心，使用Rneasy mini kit提取全細胞RNA，SuperScript?Ⅲ Reverse Transcriptase合成cDNA，Power SYBR?Green PCR Master Mix熒光實時定量PCR法測定細胞中HDAC1和p21WAF1/CIP1的mRNA表達水平。

1.2.3 Western blot將上述Leptin和SAHA處理后的MDA-MB-231細胞經胰蛋白酶消化、離心后，取細胞團塊經M-PER裂解液裂解，應用BCA法檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，PVDF轉膜、封閉。加入1︰1 000稀釋的羊抗HDAC1單克隆抗體，羊抗乙酰化組蛋白H3多克隆抗體、羊抗組蛋白H3多克隆抗體、羊抗乙酰化組蛋白H4多克隆抗體、羊抗組蛋白H4多克隆抗體和羊抗p21WAF1/CIP1多克隆抗體4℃孵育過夜，以羊抗β-actin多克隆抗體作為對照。再加入1︰5 000 HRP標記的兔抗羊多克隆抗體室溫孵育1 h，ECL化學發光法測定細胞裂解液中各因子表達變化情況。

1.2.4 ChIP 按EZ-ChIP試劑盒操作程序進行。將5×106/ml處于對數生長期的乳腺癌MDA-MB-231細胞接種于35 mm培養皿中，經血清饑餓同步化處理后，加入0.625 nmol/L Leptin和5 μmol/L SAHA共同培養（培養方法與孵育時間同1.2.2）。經預冷磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次后，37%戊二醛室溫孵育10 min使DNA和與之相互作用的蛋白交聯。PBS沖洗2次后用細胞鏟刮掉培養皿中細胞，700×g離心5 min后用SDS Lysis Buffer重新懸浮細胞團。超聲破碎細胞后離心取上清夜分別與羊抗乙酰化組蛋白H3多克隆抗體和羊抗乙酰化組蛋白H4多克隆抗體4℃過夜孵育。加入Protein G Agarose和細胞IP孵育液4℃振蕩作用1 h，5 000×g離心1 min后取Protein G Agarose/細胞IP復合物依次經低鹽、高鹽、LiCl、TE溶液沖洗后，經Elution Buffer洗脫、5 mol/L NaCl 65℃去交聯、DNA柱純化后所得沉淀即為ChIP產物。應用Power SYBR?Green PCR Master Mix熒光實時定量PCR法測定細胞與乙酰化組蛋白抗體結合的GAPDH、p21WAF1/CIP1基因啟動子片段DNA的含量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，采用Student's t-test分析軟件進行統計學處理，結果以表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Leptin通過影響組蛋白的乙酰化水平調控乳腺癌細胞的增殖 將Leptin與乳腺癌MDA-MB-231細胞作用后發現，Leptin誘導乳腺癌細胞增殖與HDAC1活力增強有明顯關系，HDAC1 mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組，同時組蛋白H3、H4乙酰化水平降低；SAHA的作用則相反，經其處理后HDAC1 mRNA和蛋白表達水平明顯低于對照組，同時組蛋白H3、H4乙酰化水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1A、1B。當應用ChIP研究與乙酰化組蛋白H3、H4作用的染色質區域時發現，Leptin處理后的乳腺癌細胞中富集于乙酰化組蛋白H3、H4區域的GAPDH啟動子片段明顯少于未處理細胞組，而SAHA處理后H3、H4區域GAPDH啟動子片段高于未處理細胞組（P＜0.05），見圖1C、1D。

圖1 Leptin誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞HDAC1的mRNA和蛋白表達及對組蛋白H3、H4乙酰化水平影響

2.2 Lepin誘導乳腺癌細胞增殖過程中伴隨p21WAF/CIP1啟動子區域活性的下降 實時定量PCR和Western blot結果發現，Leptin處理后的乳腺癌MDA-MB-231細胞p21WAF/CIP1mRNA及蛋白表達水平遠遠低于對照組細胞，而應用SAHA處理后p21WAF/CIP1的mRNA及蛋白表達水平明顯高于對照組（P＜0.05），見圖2A、2B。ChIP結果顯示：Leptin處理后的乳腺癌細胞p21WAF/CIP1啟動子區域與乙酰化組蛋白H3、H4結合的染色質物質明顯少于未處理細胞組的相同區域（P＜0.05），見圖2C、2D。

圖2 p21WAF/CIP1調控Leptin誘導HDAC1的mRNA和蛋白的表達及對組蛋白H3、H4乙酰化水平影響

3 討論

盡管乳腺癌發生和發展的原因十分復雜，但歸根到底都和基因表達及基因表達產物活性異常密切相關。隨著研究的不斷深入，人們發現表觀遺傳性狀改變在乳腺癌發生、發展中具有更普遍的意義，其作用主要是通過影響基因轉錄活性而非DNA序列突變、可經細胞分裂和增殖得以穩定遺傳［8］。正是由于表觀遺傳改變所具有的這種獨特表達調控方式使其逐漸成為乳腺癌研究和治療的熱點。在正常乳腺細胞中，組蛋白乙酰化轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）將乙酰輔酶A上的疏水乙酰基部分轉移至染色質核心組蛋白氨基末端特定賴氨酸殘基上，中和氨基上的正電荷，使DNA與組蛋白之間的空間位阻增大，使DNA易于解聚、舒展，從而轉錄因子、調節因子復合物和RNA合成酶能更好地與DNA模板相結合，激活特定基因的轉錄。而HDAC則通過移去組蛋白氨基末端賴氨酸殘基的乙酰基，恢復組蛋白的正電荷，從而與帶負電荷的DNA緊密結合，抑制基因的轉錄。在乳腺細胞功能異常時，HDAC的活性明顯增強，組蛋白處于低乙酰化狀態，基因表達平衡狀態被破壞，使一些調控細胞增殖、分化、凋亡的基因表達失衡，導致乳腺癌的形成［9-10］。

雖然目前尚無腫瘤相關HDAC突變的報道，但研究表明在乳腺癌組織中HDAC呈高表達，HDAC在乳腺癌發生、發展過程中扮演了非常重要的角色［11-13］。本研究發現，經Leptin作用乳腺癌MDA-MB-231后，細胞中HDAC1 mRNA和蛋白表達水平明顯增高，同時伴隨著核心組蛋白H3、H4乙酰化水平的降低。當應用ChIP研究與乙酰化組蛋白H3、H4作用的染色質區域時發現，Leptin作用后的乳腺癌細胞中富集于乙酰化組蛋白H3、H4區域的GAPDH啟動子片段明顯減少。這說明Leptin誘導乳腺癌細胞增殖過程中伴隨著表觀遺傳學性狀的改變，特別是組蛋白乙酰化水平的變化。進一步的實驗表明，Leptin處理后的乳腺癌細胞p21WAF/CIP1mRNA及蛋白表達水平遠遠低于Leptin未處理組細胞。當應用HDAC抑制劑SAHA作用后p21WAF/CIP1的表達水平明顯升高。ChIP分析結果顯示Leptin處理的乳腺癌細胞p21WAF/CIP1啟動子區域與乙酰化組蛋白H3、H4結合的染色質物質明顯少于未處理細胞組的相同區域，而用SAHA處理后結果則相反。這說明Leptin誘導乳腺癌細胞增殖過程中通過激活HDAC1的活性使核心組蛋白去乙酰化，從而抑制p21WAF/CIP1的表達，最終促進細胞周期從G1→S期的進程。

由于有關乙酰化/去乙酰化修飾和乳腺癌的關系還有很多問題亟待解決，特別是在p21WAF1/CIP調控乳腺癌細胞增殖過程中相關轉錄因子的具體作用方式以及去乙酰化表觀遺傳學修飾所誘導的抑癌基因特異性表達機制均值得進一步研究。本研究對于進一步探討乳腺癌發生過程中的有關表觀遺傳修飾的作用機制，拓寬乳腺癌研究方向，尋找潛在、有效的乳腺癌靶基因治療位點奠定了堅實的實驗和理論基礎。

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（文敏編輯）

Histone Acetylation Involved in Leptin-induced Proliferation ofBreastCancer MDA-MB-231 Cells

ZHOU Weiqiang

（Shenyang Medical College，Key Laboratory of Environmental Pollution and Microecology of Liaoning Province，Shenyang 110034，China）

Objective：To study the role of histone acetylation on Leptin-induced proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells.Methods：Quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the effects of Leptin and SAHA（a histone deacetylase inhibitor）on proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells.Chromatin immunoprecipitation（ChIP）was used to detect the levels of histone acetylation after Leptin and SAHA treatment.Results：Leptin significantly enhanced the HDAC1 activity in MDA-MB-231 cells，accompanied with lower levels of histone H3 and H4 acetylation（P＜0.05）.ChIP analysis showed that activated HDAC1 reduced the load of acetylated histones（H3 and H4） to the p21WAF1/CIP1promoter，which significantly decreased the expression levels of p21WAF1/CIP1mRNA and protein（P＜0.05），and accelerated the cell cycle progression.Conclusion:Leptin's effects on MDA-MB-231 cells are associated with HDAC1 activation，which decrease H3/H4 acetylation status and restrains the effects of p21WAF1/CIP1on cell cycle，thereby contributing to triple-negative breast carcinogenesis.

breast cancer；MDA-MB-231；SAHA；deacetylation

R394.3

A

1008-2344（2017）01-0011-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.01.003

2016-06-06

國家自然科學基金項目（No.81172509）

周偉強（1970—），男（漢），教授.研究方向：乳腺癌發生與調控.E-mail：zhouwq@hotmail.com