S1PR1/3介導骨髓間充質干細胞向肌成纖維細胞分化的信號通路探討

楊苑儒 周 璇 張若辰 李麗英 楊 樂*

(1.首都醫科大學2013級醫學實驗技術專業, 北京 100069；2.首都醫科大學基礎醫學院細胞生物學系，北京 100069)

·基礎研究 ·

S1PR1/3介導骨髓間充質干細胞向肌成纖維細胞分化的信號通路探討

楊苑儒1周 璇1張若辰1李麗英2楊 樂2*

(1.首都醫科大學2013級醫學實驗技術專業, 北京 100069；2.首都醫科大學基礎醫學院細胞生物學系，北京 100069)

目的 在轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)誘導的分化模型中探討RhoA信號對于磷酸鞘氨醇受體1/3(sphingosine 1-phosphate receptor 1/3， S1PR1/3)介導骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell， BMSC)向肌成纖維細胞(myofibroblast， MF)分化的影響及其機制。方法 分離并培養小鼠原代BMSC，TGFβ1誘導其分化。采用qRT-PCR檢測分化標志物平滑肌肌動蛋白α(α-smooth muscle actin， αSMA)、Ⅰ型膠原[procollagen α1(Ⅰ),Col α1(Ⅰ)]和Ⅲ型膠原[Col α1(Ⅲ)]的mRNA表達；采用Pull-down試劑盒檢測RhoA的活化。結果 TGFβ1能夠顯著上調BMSC細胞中分化標志物αSMA、Col α1(Ⅰ)和Col α1(Ⅲ)的mRNA表達，呈現劑量依賴效應。TGFβ1能夠激活小G蛋白RhoA，該作用可以被S1PR1或S1PR3拮抗劑所阻斷。RhoA抑制劑C3轉移酶能夠阻斷TGFβ1誘導的αSMA、Col α1(Ⅰ)和Col α1(Ⅲ) mRNA水平的上調。結論 RhoA信號參與了S1PR1/3介導的BMSC向MF的分化。

小鼠；骨髓間充質干細胞；磷酸鞘氨醇受體；RhoA

肝纖維化時骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)可以遷移至受損傷肝臟，分化為肌成纖維細胞(myofibroblast, MF)，從而參與肝纖維化的發生[1-2]。研究顯示[3-5]，磷酸鞘氨醇受體(sphingosine 1-phosphate receptor 1/3, S1PR1/3)參與了肝纖維化時BMSC向MF的分化；并且S1PR1/3和轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)信號通路之間存在cross-talk，TGFβ1通過上調BMSC中S1PR1和S1PR3的表達，誘導BMSC向MF的分化。但S1PR下游參與BMSC分化的信號通路尚不清楚。本實驗以原代培養的小鼠BMSC為研究對象，以S1PR1/3和RhoA為靶分子，擬在TGFβ1誘導的分化模型中探討RhoA信號對于S1PR1/3介導的BMSC向MF分化的影響及其機制。本研究有助于闡明S1PR1/3在肝纖維化治療中的具體作用機制，為肝纖維化以S1PR1/3為靶位點進行治療，提供新的思路和理論依據，具有重要的理論意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1)動物：普通ICR雄性小鼠，體質量28～30 g，SPF級，周齡6周左右，購于首都醫科大學實驗動物部。實驗動物許可證號：SYXK(京)2015-0012。

2)細胞：原代培養的小鼠骨髓間充質干細胞，本實驗室已建立其分離與培養方法。

3)主要儀器：細胞培養箱(Thermo公司，美國)，離心機(5810R，Eppendorf 公司，美國)，Real-time PCR儀(ABI 7300，ABI公司，美國)，垂直電泳裝置(Bio-Rad公司，美國)，蛋白轉印裝置(Biometra公司，德國)，Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(LI-COR公司，美國)，熒光顯微鏡(Leica公司，日本)。

4)主要試劑：a-MEM培養基(Gibco公司，美國)，胎牛血清(Biochrom公司，美國)，TGFβ1(PeproTech公司，美國)，抗平滑肌肌動蛋白α(α-smooth muscle αctin， aSMA)，單克隆抗體(Sigma公司，美國)，Cy3羊抗鼠二抗(Jackson Immunoresearch公司，美國)，紅外熒光染料標記的二抗(LI-COR公司，美國)，RNeasy Mini Kit(Qiagen公司，德國)，M-MLV反轉錄試劑盒(Invitrogen公司，美國)，SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司，美國)，Pull-down檢測試劑盒(Thermo Scientific公司，美國)。

1.2 方法

1)小鼠BMSC的分離與培養：無菌條件下取出小鼠四肢長骨，浸入預熱的PBS溶液中，去除肌肉筋膜和骨骺，以a-MEM培養基作為骨髓沖洗液，用1 mL的一次性注射器將骨髓細胞沖至細胞培養皿中。細胞懸液過400目篩網后用完全培養基[20% (體積分數)胎牛血清的a-MEM]懸浮細胞，接種到新的細胞培養皿中置于37 ℃，5% (體積分數) CO2培養。24 h后全量換液，之后每3 d半量換液1次，去除未貼壁細胞，待細胞長滿后進行傳代，即為P1代。傳代后采用15%(體積分數) 胎牛血清的a-MEM培養基繼續培養。

所有動物實驗均遵循2006年國家科技部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》和相關倫理學規范。

2)小鼠BMSC的分化：BMSC匯合度達到80%～90%后，PBS沖洗1次，更換無血清培養基培養24 h，然后加入0.2、1、2、10 ng/mL TGF-β1，同時設置對照組，處理細胞24 h后收集細胞，提取總RNA進行實時熒光定量聚合酶鏈反應，檢測平滑肌肌動蛋白α(α-smooth muscle actin，αSMA)、Ⅰ型膠原[procollagen α1(Ⅰ) ，Col α1(Ⅰ)] 和Ⅲ型膠原[Col α1(Ⅲ)]的mRNA水平。

3)實時熒光定量聚合酶鏈反應：處理后的細胞用預冷PBS清洗，加入350 μL裂解液，收集裂解底物提取全細胞RNA，定量后取0.5g反轉錄(不加反轉錄酶作為陰性對照，即NO-RT)，cDNA稀釋后進行PCR反應(引物序列詳見表1)。檢測的臨界點設定在PCR擴增過程中，熒光信號由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環數(Ct)作為模板初始濃度的間接指標，溶解曲線分析采用默認條件。結果以18S rRNA進行校正，用ΔΔCt法計算相對基因表達量。

表1 PCR引物序列

Col α1Ⅰ： procollagen α1Ⅰ; αSMA:smooth muscle actin.

4)蛋白質印跡實驗(Western blotting):在4 ℃條件下加入裂解液，提取小鼠BMSC中的蛋白質，用BCA Protein Assay Kit測定樣品蛋白質的量。每個樣本取30 μg蛋白質進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉至PVDF膜上，用含5%(質量分數)脫脂奶粉的TBST溶液室溫1 h，加入1∶500稀釋倍數的αSMA抗體于4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次10 min，加入二抗，室溫孵育1 h后，TBST漂洗3次，每次10 min，直接用Odyssey紅外熒光掃描成像系統進行掃描成像。內參采用相同步驟。

5)活化的RhoA Pull-down分析：BMSC細胞經過相應的處理之后，經裂解液裂解，檢測RhoA的GTP結合形式，最后用Western blotting展示條帶。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 TGFβ1誘導小鼠BMSC分化，呈劑量依賴效應

不同濃度TGFβ1刺激BMSC 24 h后，分化標志物aSMA、Col α1(Ⅰ)和Col α1(Ⅲ)的mRNA表達顯著上調，其中在10 ng/mL TGFβ1處理下表達量達到最大，呈現劑量依賴效應。詳見圖1。

圖1 不同濃度TGFβ1處理BMSC 24 h后 mRNA表達

A:αSMA; B:Col α1(Ⅰ); C:Col α1(Ⅲ); BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell; αSMA:α-smooth muscle actin; Col α1: procollagen α1; TBFβ1: transforming growth factor β1;*P<0.05vs0 ng·mg-1TGFβ1.

2.2 TGFβ1激活小G蛋白RhoA

10 ng/mL TGFβ1分別刺激BMSC 5、15和30 min，然后通過Pull-down分析實驗檢測與GTP結合的RhoA蛋白。結果顯示，TGFβ1能夠快速激活RhoA，且其活化水平在30 min時達到最大。詳見圖2。

2.3 阻斷S1PR1或S1PR3抑制活化的RhoA

預先用S1PR1拮抗劑W146或S1PR3拮抗劑CAY10444預孵育BMSC 1 h，然后使用10 ng/mL TGFβ1刺激細胞30 min，觀察GTP-RhoA的蛋白變化。結果顯示，TGFβ1誘導的RhoA活化能夠被S1PR1或S1PR3拮抗劑所抑制(P<0.05)。詳見圖3。

2.4 BMSC的分化依賴于RhoA信號通路

用RhoA 抑制劑C3轉移酶預孵育BMSC 1 h，然后使用10 ng/mL TGFβ1刺激細胞24 h，檢測分化標志物aSMA、Col α1(Ⅰ)和Col α1(Ⅲ)的mRNA表達。結果顯示C3轉移酶可以阻斷TGFβ1誘導BMSC分化。詳見圖4。

圖2 TGFβ1刺激能夠激活小G蛋白RhoA

BMSCs were exposed to 10 ng/mL TGFβ1 at 5, 15 and 30 minutes. Total and activated RhoA in BMSCs were determined by pull-down assay.*P<0.05vs0 min; TBFβ1: transforming growth factor β1; BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell.

圖3 S1PR1/3拮抗劑對于RhoA活化的影響

BMSCs were incubated with S1PR1 antagonist W146 (10 mmol/L) or S1PR3 antagonist CAY10444 (10 mmol/L) prior to TGFβ1 treatment (10 ng/mL, 30 min). Total and activated RhoA in BMSCs were determined by pull-down assay.*P<0.05vscontrol cells;#P<0.05vsTGFβ1-treated cells alone；TBFβ1: transforming growth factor β1； S1PR1/3： sphingosine 1-phosphate receptor 1/3； BMSC: bone marrow mesenchymal stem cell.

3 討論

肝纖維化是多種病因所致的慢性肝病共有的病理過程，肝臟肌成纖維細胞在肝纖維化發生和發展過程中起著決定性作用[6-7]。MF異源性的觀點已被學者普遍接受。前期工作[3-5]已證實，在肝纖維化發生過程中BMSC是MF的重要來源，且S1PR1和S1PR3參與了BMSC向MF的分化，然而與受體S1PR1和S1PR3結合后的下游信號通路，如MAPK、PI-3K、Akt、Rho、cAMP、和Ca2+等相關的信號途徑在BMSC分化中的作用，尚不清楚。Rho蛋白屬于小G蛋白超家族的亞家族成員，具有GTP酶活性，在信號傳導過程中起到分子開關的作用[8-9]。其家族內的代表性成員RhoA及其效應物ROCK的激活可以影響細胞的分化命運。當抑制RhoA/ROCK活性時，干細胞可以向軟骨細胞或脂肪細胞分化，而當激活它時，則促進了成骨分化[10]。本研究首次證實RhoA信號參與S1PR1/3介導的BMSC向MF的分化。本課題組的結果表明TGFβ1刺激(5、15和30 min)能夠上調活化形式RhoA的表達。并且，用拮抗劑把S1PR1或S1PR3特異性抑制以后能夠阻斷TGFβ1誘導的RhoA活化。此外，RhoA抑制劑C3轉移酶可以阻斷TGFβ1誘導的aSMA、Col α1(Ⅰ)和Col α1(Ⅲ) mRNA表達上調，從而抑制BMSC分化。

圖4 TGFβ1通過RhoA信號通路誘導BMSC分化

A:expression of aSMA mRNA; B: expression of Col α1(Ⅰ) mRNA; C: expression of Col α1 (Ⅲ) mRNA; The effect of C3 transferase (Rho A inhibitor) on BMSC differentiation was examined by qRT-PCR. TBFβ1: transforming growth factor β1； BMSC: bone marrow mesenchymal stem cell;Col α1: procollagen α1；*P<0.05vsuntreated control cells;#P<0.05vsTGFβ1-treated cells alone.

已有文獻[11]報道在不同細胞中S1P/S1PR和TGFβ1之間存在某種 cross-talk，但是它們在BMSC分化過程中的相互作用還不清楚。本研究在體外培養小鼠原代BMSC，然后用TGFβ1誘導分化，通過qRT-PCR檢測MF標志物——αSMA、Col α1(Ⅰ)和Col α1(Ⅲ)的mRNA表達，證明TGFβ1能夠誘導BMSCs向MF的分化。進而使用S1PR拮抗劑，進一步證實TGFβ1誘導BMSC分化為MF這一過程依賴于S1PR1和S1PR3。這與已發表的研究[11-12]結果相一致，有文獻[13]報道TGFβ1誘導成纖維細胞和肌原細胞的分化也依賴于S1P/S1PR信號軸，從而進一步確證S1P/S1PR和TGFβ1信號通路之間的cross-talk。

國內外對于骨髓干細胞的治療潛能進行了廣泛的研究并取得了長足的進展，在臨床肝硬化病人進行骨髓干細胞移植治療嘗試也取得了令人鼓舞的效果[14-15]。但是，實驗[1]表明，肝纖維化發生過程中產生細胞外基質的主要細胞MF，除了肝星狀細胞和成纖維細胞激活以及上皮細胞間質轉化外，至少還有部分來自于骨髓干細胞。本研究也證實了BMSC可以分化為MF從而參與肝纖維化的發生。因此，本課題組的研究結果提示在BMSC應用于治療肝硬化等疾病時不應低估它可能會分化為MF，從而促進纖維化發生的潛能。

總之，本研究探討了RhoA信號在S1PR1/S1PR3介導BMSC向MF分化過程中的重要作用，這可能是S1PR1/3發揮促炎和促纖維化作用的主要機制。闡明這一機制將有助于制定新的特異的抗纖維化治療方案，具有重要的理論意義和應用價值。

[1] Forbes S J, Russo F P, Rey V, et al. A significant proportion of myofibroblasts are of bone marrow origin in human liver fibrosis[J]. Gastroenterology,2004, 126(4):955-963.

[2] Lyra A C, Soares M B, Dos S R, et al. Bone marrow stem cells and liver disease[J]. Gut, 2007, 56(11):1640, 1640-1641.

[3] Yang L, Chang N, Liu X, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiate to hepatic myofibroblasts by transforming growth factor-beta1 via sphingosine kinase/sphingosine 1-phosphate (S1P)/S1P receptor axis[J]. Am J Pathol,2012, 181(1):85-97.

[4] Li C, Kong Y, Wang H, et al. Homing of bone marrow mesenchymal stem cells mediated by sphingosine 1-phosphate contributes to liver fibrosis[J]. J Hepatol,2009, 50(6):1174-1183.

[5] Li C, Jiang X, Yang L, et al. Involvement of sphingosine 1-phosphate (SIP)/S1P3 signaling in cholestasis-induced liver fibrosis[J]. Am J Pathol,2009, 175(4):1464-1472.

[6] Robinson M W, Harmon C, O’Farrelly C. Liver immunology and its role in inflammation and homeostasis[J]. Cell Mol Immunol,2016, 13(3):267-276.

[7] Friedman S L. Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J]. Gastroenterology,2008, 134(6):1655-1669.

[8] Mali R S, Kapur S, Kapur R. Role of Rho kinases in abnormal and normal hematopoiesis[J]. Curr Opin Hematol,2014, 21(4):271-275.

[9] Hoon J L, Tan M H, Koh C G. The regulation of cellular responses to mechanical cues by Rho GTPases[J]. Cells,2016, 5(2)：E17.

[10]Xu T, Wu M, Feng J, et al. RhoA/Rho kinase signaling regulates transforming growth factor-beta1-induced chondrogenesis and actin organization of synovium-derived mesenchymal stem cells through interaction with the Smad pathway[J]. Int J Mol Med,2012, 30(5):1119-1125.

[11]Kono Y, Nishiuma T, Nishimura Y, et al. Sphingosine kinase 1 regulates differentiation of human and mouse lung fibroblasts mediated by TGF-beta1[J]. Am J Respir Cell Mol Biol,2007,37(4):395-404.

[12]Gellings Lowe N, Swaney J S, Moreno K M, et al. Sphingosine-1-phosphate and sphingosine kinase are critical for transforming growth factor-beta-stimulated collagen production by cardiac fibroblasts[J]. Cardiovasc Res,2009, 82(2):303-312.

[13]Cencetti F, Bernacchioni C, Nincheri P, et al. Transforming growth factor-beta1 induces transdifferentiation of myoblasts into myofibroblasts via up-regulation of sphingosine kinase-1/S1P3 axis[J]. Mol Biol Cell,2010, 21(6):1111-1124.

[14]Terai S, Ishikawa T, Omori K, et al. Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy[J]. Stem Cells,2006, 24(10):2292-2298.

[15]Cho K A, Lim G W, Joo S Y, et al. Transplantation of bone marrow cells reduces CCl4-induced liver fibrosis in mice[J]. Liver Int,2011, 31(7):932-939.

編輯 孫超淵

Signaling of bone marrow mesenchymal stem cell differentiation to myofibroblasts mediated by S1PR1/3

Yang Yuanru1, Zhou Xuan1, Zhang Ruochen1, Li Liying2， Yang Le2*

(1.Grade2013MedicalLaboratoryAnimalScience,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069; 2.DepartmentofCellBiology,SchoolofBasicMedicalSciences，CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Objective Aim of this study is to explore the role of RhoA in transforming growth factor β1 (TGFβ1)-induced bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) differentiation to myofibroblast (MF) mediated by sphingosine 1-phosphate receptor 1/3 (S1PR1/3). Methods Serum-starved primary cultured mouse BMSCs were stimulated by a series dose of TGFβ1. Expression of α-smooth muscle actin (αSMA), procollagen α1(Ⅰ) [Col α1(Ⅰ)] and procollagen α1(Ⅲ) [Col α1(Ⅲ)] was measured by qRT-PCR. Activated RhoA induced by TGFβ1 in BMSCs was determined by Pull-down assay. Results TGFβ1 induced an up-regulation of αSMA, Col α1(Ⅰ) and Col α1(Ⅲ) mRNA levels in BMSCs. TGFβ1 triggered the activation of RhoA, which can be blocked by S1PR1/3 antagonists. RhoA inhibitor C3 Transferase reversed the up-regulation of αSMA, Col α1(Ⅰ) and Col α1(Ⅲ) mRNA expression induced by TGFβ1. Conclusion RhoA is involved in the differentiation of BMSC to MF induced by TGFβ1.

mouse; bone marrow mesenchymal stem cell; sphingosine 1-phosphate receptor; RhoA

北京市自然科學基金(7164237)，北京市優秀人才培養資助(2014000020124G156)。This study was supported by Natural Science Foundation of Beijing (7164237),Beijing Municipal Foundation for the Excellent Talents (2014000020124G156).

時間：2017-04-13 19∶54

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.1954.030.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.022]

Q2

2016-06-02)

*Corresponding author， E-mail：yangle@ccmu.edu.cn