糖化白蛋白誘導人近端腎小管上皮細胞產生損傷與炎性反應的表達

段 楠 劉 怡 李海霞 焦莉莉

(北京大學第一醫院檢驗科，北京 100034)

·基礎研究 ·

糖化白蛋白誘導人近端腎小管上皮細胞產生損傷與炎性反應的表達

段 楠 劉 怡 李海霞*焦莉莉

(北京大學第一醫院檢驗科，北京 100034)

目的 探討在糖化白蛋白(glycated albumin，GA)刺激下，人近端腎小管上皮細胞(HK-2細胞系)中腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)、中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)及炎性反應相關細胞因子的表達情況。方法 分別采用不同濃度的GA與白蛋白(albumin，Alb)刺激HK-2細胞12 h、24 h及48 h，通過real-time PCR和酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunesorbent assay，ELISA)分別檢測NGAL、KIM-1的mRNA表達與蛋白釋放水平，并運用流式液相多重蛋白定量技術檢測血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)和可溶性細胞間黏附分子-1(soluble intercellular cell adhesion molecule-1，sICAM-1)等細胞因子的濃度。結果 與對照組與Alb組比較，GA刺激HK-2細胞12 h、24 h和48 h均能顯著上調KIM-1和NGAL的mRNA表達(P<0.05)以及KIM-1和NGAL蛋白的釋放(P<0.05)；GA組sICAM-1、VEGF與IL-8水平在各時間點均高于Alb組和對照組(P<0.05)。結論 GA能上調KIM-1和NGAL mRNA的表達與蛋白的釋放，并促進炎性細胞因子的分泌從而對腎小管造成損傷，提示GA可反映糖尿病腎臟受累情況。

糖化白蛋白；近端腎小管上皮細胞；腎損傷分子-1；中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白；細胞因子

糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最主要的微血管病變之一，為終末期腎病的主要病因之一。自2011年以來，我國糖尿病相關的慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)比例已超過腎小球腎炎導致的CKD[1]。2型DM導致的DKD中，腎小球的病理改變并不常見，主要病變是小管間質炎性反應或血管損傷[2]。晚期糖基化終產物(advanced glycation end products，AGEs)與DM血管合并癥如DKD的發病機制密切相關[3]。糖化白蛋白(glycated albumin，GA)是AGEs的前體之一，主要應用于監測近期(2～3周)血糖的控制情況。有實驗[4]證明GA能夠促進近端腎小管上皮細胞中炎性反應因子如可溶性細胞間黏附分子-1(soluble intercellular cell adhesion molecule-1，sICAM-1)和白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)的釋放，上調腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)的合成[5]，但腎小管損傷標志物中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)的表達如何尚不明確。本研究擬進一步以不同濃度的GA刺激人近端腎小管上皮細胞(HK-2細胞系)，并于不同時間點觀察腎小管損傷相關分子NGAL和KIM-1及炎性反應相關細胞因子血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等的表達情況。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人GA、人白蛋白(albumin，Alb)(Sigma公司，美國)，DMEM F-12培養基(Hyclone公司，美國)，胎牛血清(Gibco公司，美國)，青霉素、鏈霉素和兩性霉素B(Lonza公司，美國)，胰蛋白酶消化液(Gibco公司，美國)，Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)，cDNA反轉錄試劑盒(Invitrogen公司，美國)，SYBR?GreenPCR熒光染料(Invitrogen公司，美國)，人類KIM-1和NGAL Elisa試劑盒(R&D公司，美國)，人類VEGF、TNF-α、IL-8和sICAM-1流式液相多重蛋白定量試劑盒(BD公司，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

實驗使用人近端腎小管上皮細胞HK-2細胞系，購自美國標準培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。細胞培養于含有10%(體積分數)胎牛血清體積比，1×10 000 U/L青霉素、10 000g/L鏈霉素及20g/L兩性霉素B的DMEM-F12培養基中傳代培養，培養于37 ℃、 5%(體積分數)CO2飽和濕度空氣培養箱。倒置顯微鏡下觀察形態，3d左右HK-2細胞生長融合成單層細胞，呈典型的鋪路石狀鑲嵌排列。

1.2.2 細胞分組與刺激

取生長良好的細胞接種于6孔版，待細胞生長至視野70%～80%匯合時，無血清DMEM-F12培養基同步化12 h，隨機分成對照組與實驗組：(1)空白對照組：無刺激；(2)人Alb對照組：4個Alb濃度梯度亞組(0.5 g/L、1.0 g/L、5 g/L[5]、10 g/L)(3)人GA組：分為2個GA濃度梯度亞組(0.5 g/L[5]、1.0 g/L)。對以上各組細胞分別進行12 h、24 h與48 h的刺激。每組實驗至少重復3次。

1.2.3 實時熒光定量PCR測定細胞中KIM-1與NGAL mRNA含量

按照Trizol說明書提取各組細胞總RNA，以2 μg總RNA按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄獲得cDNA，在ABI 7500儀器(Life Tech, Applied Biosystems)進行熒光實時定量PCR(real-time PCR)。總反應體積20L，反應條件：預變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s及退火60 ℃ 60 s(共40個循環)。引物設計使用Primer Premier 6.0，由生工(上海)公司合成，稀釋為 10 μmol/L工作液，序列見表1。每次3個復孔，每個實驗重復3次。目的基因mRNA Ct 值用GAPDH Ct值校正。根據所得Ct值，運用2-ΔΔCT相對定量法計算內參、目的基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.2.4 酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunesorbent assay，ELISA)測定培養上清液中KIM-1與NGAL濃度

各組細胞在相應物質不同濃度與不同時間刺激后，分別收集上清液。按照說明書進行ELISA反應，各步驟結束后30 min內使用酶標儀于450 nm波長處讀取每孔吸光度值，根據吸光度值與倍比稀釋濃度建立KIM-1和NGAL濃度的標準曲線，樣品中KIM-1和NGAL濃度從標準曲線讀取。

1.2.5 流式液相多重蛋白定量檢測培養上清液中細胞因子濃度

各組細胞在相應物質不同濃度與不同時間刺激后，分別收集上清液。按照說明書步驟進行操作各步驟，使用CantoⅡ儀器(BD)應用流式技術讀取上樣管中位熒光強度值，根據中位熒光強度值與倍比稀釋濃度分別建立VEGF、TNF-α、IL-8和sICAM-1濃度的標準曲線，樣品中細胞因子濃度從標準曲線讀取。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 GA與Alb對HK-2細胞KIM-1和NGAL mRNA表達的影響

HK-2細胞用不同濃度GA和Alb(0.5 g/L GA與等量0.5 g/L Alb和10倍量5 g/L Alb組；1.0 g/L GA與等量1.0 g/L Alb和10倍量10 g/L Alb組)刺激12 h、24 h和48 h后，以實時熒光定量PCR檢測KIM-1和NGAL mRNA的表達。細胞在3組時間刺激下KIM-1和NGAL mRNA的表達差異均無統計學意義(P=0.070,P=0.150)，不同Alb濃度組KIM-1、NGAL mRNA的表達差異無統計學意義(P>0.05)。與空白對照組和Alb對照組比較，GA刺激HK-2細胞12 h、24 h和48 h后，都顯著提高每個時間點KIM-1和NGAL mRNA的表達(P<0.05)。0.5 g/L GA組與1.0 g/L GA組相比，具有較高的KIM-1和NGAL mRNA的表達，其中24 h的KIM-1 mRNA和12 h的NGAL mRNA比較，差異有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

2.2 GA與Alb對HK-2細胞KIM-1和NGAL釋放的影響

刺激24 h后細胞KIM-1的釋放顯著高于12 h (P<0.05)，但NGAL的釋放在12 h與24 h之間無顯著性改變(P=0.140)；刺激48 h后細胞KIM-1和NGAL的含量均顯著高于12 h與24 h(P<0.05)，達到最高水平。與空白對照組比較，GA刺激12 h時HK-2細胞KIM-1和NGAL均出現顯著上升(P<0.05)，刺激24 h二者的變化均不明顯，刺激48 h時KIM-1含量顯著升高(P<0.05)，而NGAL濃度的改變差異無統計學意義(P>0.05)。與Alb對照組比較，GA刺激12 h后0.5 g/L GA組中KIM-1釋放顯著高于0.5 g/L Alb組(P<0.05)，NGAL釋放改變不明顯。刺激24 h后，1.0 g/L GA組KIM-1顯著高于10 g/L Alb組(P<0.05)，0.5 g/L GA組NGAL的釋放顯著高于5 g/L Alb組(P<0.05)(圖2)。刺激48 h后，KIM-1和NGAL的釋放均在0.5 g/L GA組顯著高于 5 g/L Alb組，在1.0 g/L GA組顯著高于1.0 g/L Alb組(P<0.05)(圖2)。

圖1 不同濃度下各時間點GA與Alb對HK-2細胞KIM-1及NGAL mRNA水平的影響

圖2 不同濃度下各時間點GA與Alb對HK-2細胞釋放KIM-1及NGAL的影響

2.3 GA與Alb對HK-2細胞釋放細胞因子的影響

各刺激組細胞培養上清液中均未檢測到TNF-α有效值。刺激HK-2細胞不同時間后，24 h下細胞sICAM-1、VEGF和IL-8的含量顯著高于12 h(P<0.05)；48 h下各組細胞上述因子的濃度顯著高于12 h與24 h(P<0.05)，達到最高水平。與對照組相比，GA組具有顯著較高的sICAM-1(圖3A)、VEGF(圖3B)和IL-8(圖3C)水平(P<0.05)；與Alb組相比，GA組也同樣具有較高的sICAM-1、VEGF和IL-8釋放。其中，GA刺激12 h后，sICAM-1、VEGF和IL-8含量均顯著高于相應Alb組(P<0.05)；刺激24 h后，s-ICAM和VEGF的釋放顯著高于相應Alb組(P<0.05)，IL-8含量改變不明顯；刺激48 h后，1.0 g/L GA組sICAM-1含量顯著高于相應Alb組(P<0.05)，VEGF釋放改變不明顯，0.5 g/L GA組IL-8顯著高于5 g/L Alb組(P<0.05)。另外，各個時間點1.0 g/L GA組sICAM-1的釋放顯著高于0.5 g/L GA組(P<0.05)(圖3A)。

3 討論

本研究利用GA刺激人近端腎小管上皮細胞(HK-2細胞)模擬糖尿病腎病腎小管損傷的細胞模型，觀察到GA能促進KIM-1和NGAL等腎小管損傷相關分子的表達與釋放，并且誘導炎性細胞因子VEGF、sICAM-1與IL-8的產生，提示AGEs能夠以GA的形式造成腎小管細胞的損傷和炎性反應。

糖尿病腎病的發病機制不明，許多因素參與其發病過程。其中，持續高血糖導致蛋白質非酶促糖基化所形成的AGEs可能是造成糖尿病腎臟損傷的機制之一，高血糖與AGEs共同影響腎小管的功能[3]。已知白蛋白約占人血漿蛋白濃度的70%，糖基化會影響其正常生理功能，糖化白蛋白是臨床上監測血糖的重要指標之一。本研究模擬體外糖基化刺激腎損傷的細胞模型，將HK-2細胞置于人血清GA與Alb的環境中，觀察GA引起的腎小管損傷相關分子和炎性細胞因子的表達。在刺激濃度條件選擇中，考慮到人體環境下GA與Alb比例的正常范圍，將其設立為：0.5 g/L、GA[5]0.5 g/L Alb(等量)和5 g/L Alb[5](10倍量)組，并增設了大劑量GA處理組(1.0 g/L)以及相應的1.0 g/L Alb(等量)和10 g/L Alb(10倍量)組，探討不同濃度GA處理是否與腎小管細胞損傷和炎性反應程度存在量效關系。

近端腎小管上皮細胞是糖尿病腎病腎小管間質損傷和腎功能下降的關鍵所在，Ⅰ型跨膜糖蛋白KIM-1表達于去分化近端腎小管上皮細胞，在腎損傷時釋放到尿液中并且與腎小管間質的炎性反應和纖維化相關，被認為是早期腎損傷的標志物。研究[5]顯示，短時間(4 h)單純高糖處理HK-2細胞無KIM-1釋放。本研究顯示，單純Alb(同濃度及高濃度)處理對HK-2細胞KIM-1的表達沒有影響；而經GA刺激后，HK-2細胞KIM-1 mRNA的表達和培養液中的蛋白含量(于48 h達到最高值)均明顯升高，以低濃度GA(0.5 g/L)組尤為明顯。已知KIM-1在腎小管損傷中的表達積聚可誘導慢性小管間質炎性反應，促使腎臟纖維化而進一步導致腎功能下降。本研究結果提示GA(而非高糖或Alb)會導致近端腎小管上皮細胞中KIM-1的表達升高，且隨時間延長而持續上調并釋放，可能會進一步對腎小管功能造成損傷。

圖3 不同濃度下各時間點GA與Alb對HK-2細胞釋放細胞因子的影響

NGAL是一種小分子量分泌性蛋白，在腎臟受到損傷性刺激時由腎小管上皮細胞分泌至血液、尿液中，是診斷急性腎損傷最有效的生物學標志之一。在低蛋白飲食控制的Ⅰ型糖尿病病人中，尿NGAL每年升高15%并與終末期腎病和死亡密切相關[6]。也有研究[7]發現，糖尿病病人NGAL的出現早于腎小球損傷指標微量白蛋白尿，能早期預警糖尿病腎病的發生。本研究表明，HK-2細胞經GA處理后，各時間點NGAL的mRNA表達與蛋白釋放顯著高于對照組和Alb組，且蛋白釋放在48 h達到最高值。因此，NGAL可能在糖基化誘導近端腎小管上皮細胞損傷中發揮作用，且一定程度上能早期評估糖尿病病人的腎臟受累情況。

有研究[8-10]顯示糖尿病腎病屬于非炎性疾病，但近年來發現糖尿病病人和實驗動物模型的腎臟中均有巨噬細胞的浸潤增加以及白細胞介素、細胞黏附分子的過量產生[11-12]。由內皮分泌到細胞外基質的VEGF能夠調節腎小管上皮細胞的代謝過程并抑制其凋亡；慢性炎性反應中所涉及的T細胞和巨噬細胞及其釋放的細胞因子均表現出促炎活性，其中主要為IL-1的表達增加，并進一步引起VEGF、ICAM-1、IL-6、IL-8和血管緊張素Ⅱ的升高[13-14]。本實驗結果顯示細胞中sICAM-1、VEGF和IL-8的釋放隨時間延長而上升并于48 h達到最高值，并且各因子在GA組中的濃度均高于對照組及Alb組。目前，動物實驗[11]表明白細胞介素和細胞黏附分子參與糖尿病腎病的發生發展，并有體外實驗[4]證實GA能促進近端腎小管上皮細胞表達sICAM-1和IL-8。本實驗結果與這些研究基本一致，并發現不同濃度GA還能夠刺激sICAM-1表達上調，且濃度為1.0 g/L GA的刺激效果強于文獻[4]所報道的0.5 g/L。這些研究結果表明GA刺激腎小管細胞表達趨化因子與黏附分子等炎性細胞因子，使炎細胞在糖尿病腎小管病變期間遷移到間質空間(interstitial space)，進一步對近端腎小管上皮細胞造成損傷。

綜上所述，作為AGEs前體，GA能上調KIM-1和NGAL等腎損傷相關分子的表達與釋放，促進炎性反應中sICAM-1、VEGF和IL-8等細胞因子的產生，對人近端腎小管上皮細胞造成損傷。因此，對糖尿病病人進行GA、腎損傷相關分子和細胞因子的檢測，可提示與評估糖尿病病人腎臟受累情況，預測糖尿病腎病的發生發展，也對開發針對GA的藥物或分子以干預糖尿病腎病提供理論依據。

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編輯 慕 萌

Effects of glycated albumin on inducing injury and inflammation in human proximal tubular epithelial cells

Duan Nan，Liu Yi，Li Haixia*，Jiao Lili

(DepartmentofClinicalLaboratory,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China)

Objective To investigate the effects of glycated albumin (GA) on the expression of kidney injury molecule-1 (KIM-1), neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and inflammatory cytokines in human proximal tubular epithelial cells (HK-2 cells). Methods The HK-2 cells were treated with the different concentrations of GA and albumin (Alb) for 12h, 24h and 48h. The mRNA expressions of KIM-1 and NGAL were detected by real-time PCR. The release of KIM-1 and NGAL in the supernatants were detected by ELISA. The concentrations of VEGF, TNF-α, IL-8 and sICAM-1 were detected by cytometric beads array method. Results Compared with control and Alb groups, the mRNA levels of KIM-1 and NGAL in HK-2 cells were significantly up-regulated at 12 h, 24 h and 48 h after GA treatment (P<0.05); the protein levels of KIM-1 and NGAL released in supernatants of GA-treated cells were significantly higher than those in control group and Alb groups at the same time points (P<0.05); GA groups also had significantly higher levels of sICAM-1, VEGF and IL-8 than control group at each time point (P<0.05). Conclusion GA can up-regulate the expression and release of KIM-1 and NGAL and promote the secretion of inflammatory cytokines which could cause damage to renal tubules, suggesting that GA may reflect the diabetic renal involvement.

glycated albumin; proximal tubular epithelial cell; kidney injury molecule-1; neutrophil gelatinase-associated lipocalin; cytokines

時間：2017-04-13 19∶52

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.1952.026.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.024]

R692.6

2016-12-30)

*Corresponding author， E-mail：leehaixia@139.com