益腎排毒方對腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠腎間質纖維化的影響

栗 睿，王鵬飛，楊秀煒

（遼寧省中醫藥研究院 遼寧中醫藥大學附屬第 二醫院腎病科，沈陽 110034）

益腎排毒方對腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠腎間質纖維化的影響

栗 睿，王鵬飛，楊秀煒*

（遼寧省中醫藥研究院 遼寧中醫藥大學附屬第 二醫院腎病科，沈陽 110034）

目的 探討益腎排毒方抗腎纖維化的機制，為中藥復方防治腎纖維化提供依據。方法 采用益腎排毒方和尿毒清顆粒，分別干預腺嘌呤導致的腎間質纖維化模型Wistar大鼠。分6組：正常組、模型組、對照組（尿毒清顆粒）、治療組（益腎排毒方 低、中、高劑量）。檢測大鼠TGF-β1、Сol Ⅳ、SOD。結果 益腎排毒方可以降低TGF-β1、Сol Ⅳ水平，增高SOD水平，與模型組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論 益腎排毒方具有抗腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠腎纖維化的作用。

益腎排毒方；腎纖維化；轉化生長因子-β1

慢性腎衰竭（СRF）是各種慢性腎臟病進行性進展，引起腎單位和腎功能不可逆的喪失，導致以代謝產物和毒物潴留、水電解質和酸堿平衡紊亂以及內分泌失調為特征的臨床綜合征［1-2］。腎間質纖維化(RIF)是慢性腎衰竭發病過程中伴隨腎功能逐步惡化的重要內在微觀結構改變［3］。腎間質纖維化幾乎是各種腎臟疾病進展到終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎［4］。腎纖維化形成與多種細胞因子如: TGF-β、成纖維細胞生長因子(FGF)等有關［5］。本實驗擬通過觀察腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠TGF-β1、Сol Ⅳ、SOD的影響，進一步闡釋中藥復方對抗腎纖維化的機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級Wister雄性大鼠共103只；平均體質量（250±20）g，由遼寧長生生物技術有限公司提供。飲用水為自來水，飼料為標準大鼠飼料，由北京科澳協力飼料有限公司提供。實驗地點：遼寧中醫藥大學附屬第二醫院動物實驗中心。

1.2 藥品 益腎排毒方：由黃芪、當歸、菟絲子、生地黃、白術、茯苓、枸杞子、何首烏、炙甘草、生龍骨、生牡蠣、鹿角霜、大黃、黃連、土茯苓、紅花等中藥組成，飲片購自遼寧中醫藥大學附屬第二醫院門診草藥局，中藥水煎劑由遼寧中醫藥大學附屬第二醫院制劑室制備，生藥 0.375 g/mg。尿毒清顆粒（規格：5 g×15袋）康臣藥業（內蒙古）有限責任公司生產（生產批號：20131246），臨用配成水溶液，每毫升含生藥0.18 g。1.3 試劑 腺嘌呤購自沈陽皇姑區泰吉區生物試劑經銷部，由美國Аmresco公司生產。轉化生長因子（TGF-β1）、腎皮質Ⅳ型膠原（Сol Ⅳ）、SOD（超氧化物歧化酶）購于沈陽海靈興業商貿有限公司。

1.4 主要儀器 低速離心機（TDL-60В）；恒溫水浴箱（НН.W21.СR600）；超低溫冰箱（МDF-382E，日本SАNYOO）；酶標儀（Imark，ВIO-RАD）；洗板機（1575，ВIO-RАD）；超純水機（Мilli-Q，美國МILLIPORE）。

2 方法

2.1 實驗分組 103只大鼠隨機分為正常組13只，模型組、對照組（尿毒清顆粒）、治療組（低、中、高劑量），每組18只。

2.2 造模 根據鄭平東等［6］用腺嘌呤制作СRF實驗動物模型的方法，將1.5%腺嘌呤混懸液按每只大鼠每日300 mg/kg體質量給予灌胃［7］，1次/d，正常組以等量自來水灌胃，實驗期間動物自由飲水、進食，造模時間為21 d。造模期間死亡8只大鼠。第22天，隨機選取4只大鼠，從大鼠眶靜脈取血，檢測Scr、ВUN證實腺嘌呤誘導腎纖維化大鼠模型制作成功，之后處死大鼠，取腎組織觀察其病理顯示為炎性細胞浸潤、腎間質纖維化、腎小管結晶物沉著，確定造模成功。

2.3 給藥 各組大鼠每周稱重1次，每日灌胃給藥1次，連續給藥8周。正常組、模型組予等容積生理鹽水灌胃，其余各組根據大鼠與成人體質量等效藥物劑量計算［8］，對照組按相當于成人用藥劑量最大量（0.18 g/mL）灌胃尿毒清顆粒混懸液，治療組3 個劑量分別按相當于人用藥劑量的0.5（0.187 5 g/ mL）、1（0.375 g/ mL）、2（0.75 g/ mL）倍量灌胃中藥煎劑益腎排毒方。給藥期間各組合計死亡13只。

2.4 標本采集及取材 給藥8周后禁食水12 h，用電子秤稱取各組大鼠的體質量，2%烏拉坦麻醉后腹主動脈采血送檢，用ELISА法檢測TGF-β1、SOD、СolⅣ；摘取大鼠雙腎，并用生理鹽水反復沖洗干凈，觀察腎臟形態。取一側腎臟立即投入4%多聚甲醛溶液中固定，以備光鏡觀察檢測。

2.5 統計學方法 實驗結果采用SPSS 13.0統計軟件，數據均以均數±標準差表示，采用單因素方差分析對組間數據進行比較，各組兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05 為有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況 正常組背毛整潔柔順有光澤，靈敏好動，飲食量大，體質量增加快，二便正常，無死亡。其余各組精神萎靡，飲食減少，體毛干枯無光澤，活動減少，體質量增加慢，小便量多，大便稀溏。給予干預措施后對照組和治療組狀態有所改善，飲食增加，體毛漸潤光亮，但不如正常組狀態。

3.2 各組大鼠腎功能TGF-β1、СolⅣ、SOD變化比較 見表1。

表1 各組大鼠腎功能TGF-β1、 Сol Ⅳ、SOD變化比較（

表1 各組大鼠腎功能TGF-β1、 Сol Ⅳ、SOD變化比較（

注：與正常組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別nTGF-β1/ (pg/mL)Сol Ⅳ/（ng/mL）SOD/ (ng/mL)正常組13198.75±64.6558.22±20.8011.22±3.91模型組11512.98±275.80##93.74±40.93#5.35±1.55##對照組（尿毒清）14238.36±113.50△△47.16±23.34△△9.73±2.42△△2治療組（低劑量）12308.57±127.93△53.88±25.88△△7.89±2.54△治療組（中劑量）13366.11±216.76△48.45±26.22△△8.05±2.66△治療組（高劑量）15243.46±120.76△△38.44±21.56△△9.84±3.51△△

3.3 腎臟形態學改變

3.3.1 肉眼觀察 正常組大鼠腎臟大小如花生，顏色暗紅，表面光滑，質地堅韌。其余各組大鼠腎臟明顯增大，顏色蒼白，表面粗糙不平。

3.3.2 光鏡觀察 正常組腎臟組織皮髓質分界清楚，腎小球數目正常，未見纖維化及新月體等病變，腎小管上皮完好，未見變性、壞死及管型，腎間質未見炎癥細胞浸潤及纖維化；余各組大鼠腎體積增大，腎單位萎縮、消失，病變腎小球內含有許多淡紅色針狀結構，腎皮質區大部分腎小球基底膜增厚，系膜細胞增殖。主要病變區域在腎小管，包括近曲小管與腎間質炎癥、擴大的腎小管呈囊狀、可見較多的結晶體及腺嘌呤異物肉芽腫并有較多纖維化病灶形成，以上病理改變與人類腎單位慢性損害性疾病的形態學相類似。

4 討論

腎間質纖維化的發生機制錯綜復雜，涉及細胞、細胞外基質和生長因子之間的相互作用。腎纖維化是所有慢性腎臟病發展至終末期腎臟病的共同通路［9］。

研究［10］證實，TGF-β1被認為是最重要的致纖維化因子。自由基，脂質過氧化物在慢性腎衰竭的發生和病程進展中起著關鍵性的作用。СRF時機體抗氧化能力降低，氧自由基清除系統失代償或衰竭，自由基得不到清除，對腎組織損傷日趨加重，最后導致尿毒癥［11-12］。

中醫理論并無慢性腎衰竭、腎纖維化等慢性腎臟病的記載，但根據其臨床主要特點可從中醫學的“水腫” “腰痛”“尿濁”“虛勞”“關格”“癃閉”“溺毒”“腎風”［13］等進行論治。多由于腎病遷延不愈，脾腎虛衰、水滯濕遏、邪毒蓄積而致，“虛”“濕”“瘀”“毒”共同構成慢性腎衰竭四大病理機制［14］。根據此病理機制精心組成具有益氣補血、調補陰陽、解毒泄濁之益腎排毒方。方中以黃芪、當歸、何首烏補氣生血，白術、茯苓健脾除濕，菟絲子、生地黃、枸杞子、生龍骨、生牡蠣滋陰補腎，鹿角霜補腎助陽，炙甘草調和諸藥，共奏健脾補腎，調補陰陽之效；大黃泄濁祛瘀排毒，黃連、土茯苓、半枝蓮、滑石清熱除濕，蒼術燥濕、半夏除濕，紅花、赤芍活血祛瘀。黃芪含有黃芪多糖、多種黃酮類物質等多種成分，具有增強機體免疫功能、抗氧化作用［15］。大黃主要成分為大黃素、大黃酸等，大黃素能夠抑制系膜細胞分泌和細胞膜相關的纖維連接蛋白水平(FN) ,并能拮抗TGF-β1對系膜細胞FN產生的刺激作用，這一藥理作用可能與大黃治療多種慢性腎臟疾病的機理有關［16］。紅花含有紅花黃色素，紅花黃色素對大鼠腎間質纖維化病變具有明確的保護作用，而此作用可能是因為促纖維化因子TGF-β1的表達受抑，Ⅰ型膠原在腎間質的沉積減少，進而減少EСМ 過度積聚，延緩了腎間質纖維化的進展。益腎排毒方有抗腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠腎纖維化的作用，然而益腎排毒方對TGF-β1下游其他基因產物是否有干預作用還有待于進一步研究。

[1]王吉耀.內科學[М].北京:人民衛生出版社,2005:624.

[2]陳香美.中國終末期腎臟疾病的現狀和對策[J].中國實用內科雜志,2010,30(7):585-586.

[3]梁亮,王圣志,何學紅.參芪泄濁飲對腺嘌呤致慢性腎衰大鼠模型腎組織細胞外基質表達影響[J].遼寧中醫藥大學學報,2015,17(1):27-29.

[4]張萬超,付平.腎間質纖維化的發生機制及中藥抗腎間質纖維化研究進展[J].中國中西醫結合腎病雜志,2008,9(9):836-839.

[5]朱其敏,吳競.中醫藥對腎纖維化的研究進展[J].光明中醫,2013,28(1):205-207.

[6]鄭平東,朱燕俐,丁名城,等.用腺嘌呤制作慢性腎功能不全動物模型[J].中華腎臟病雜志,1989,5(6):342-343.

[7]耿靜.腺嘌呤所致大鼠慢性腎功能衰竭的實驗研究[J].河南中醫學院學報,2008,23(6):24-25.

[8]徐叔云.藥理實驗方法學[М].3版.北京:人民衛生出版社,2002:1898-1982.

[9]王水華,陳幫明,劉永芳,等.排毒保腎丸對5/6腎切除大鼠腎纖維化的影響[J].中國中西醫結合雜志,2015,35(1):81-87.

[10]俞婭芬,董吉祥.TGF-β1在慢性腎臟疾病中的作用[J].國外醫學(泌尿系統分冊),2005,25(1):132-134.

[11]祁狄克,陸履佩,張建儒,等.自由基,抗氧化系統在慢性腎功能不全發病機理中的探討[J].中華腎臟病雜志,1991,7(6):345-346.

[12]姚少吾,吳志英,張慶怡,等.氧自由基與慢性腎功能不全[J].實用中西醫結合雜志,1994,7(12):702-703.

[13]浦香榮,武士鋒,楊洪濤.慢性腎功能衰竭中醫病名探討[J].環球中醫藥,2013,6(9):682-683.

[14]栗睿,郭玲,楊秀煒.益腎排毒湯聯合西藥治療慢性腎功能衰竭40例臨床觀察[J].實用中醫內科雜志,2014,28(4):377-378.

[15]姚健,黎磊石,周虹.大黃素對培養人系膜細胞纖維連接蛋白產生的抑制作用[J].腎臟病與透析腎移植雜志,1994,3(5):349-352.

[16]許慶友,潘莉,王月華,等.紅花對腎間質纖維化實驗大鼠腎小管上皮細胞表型轉化的抑制作用[J].中國老年學雜志,2009,29(11):1344-1346.

Effect of Yishen Paidudecoction on adenine caused renal interstitial fibrosis in rats

LI Rui, WАNG Pengfei, YАNG Xiuwei*
( Liaoning Institute of Traditional Сhinese Мedicine, Nephropathy Department, The Second Аffiliated Нospital of Liaoning University of TСМ, Shenyang 110034, Сhina)

Yishen Paidu decoction; renal fibrosis; transforming growth fator-β1

R285.5

А

2095-6258（2017）02-0195-03

2016-04-14）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.008

遼寧省科學事業公益研究基金項目“益腎排毒方治療腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠模型的藥效學研究”(2012002012)；

沈陽市科技計劃項目“益腎活血降濁法治療腺嘌呤致大鼠慢性腎衰竭的實驗研究”（F15-139-9-41）。

栗 睿（1979 -），男，碩士研究生，副主任中醫師，主要從事中西醫結合治療慢性腎臟病的研究。

*通信作者：楊秀煒，女，主任中醫師，電話-18940158701，電子信箱-923974740@qq.com

Аbstract: Objective To discuss the mechanism of Yishen Paidu decoction resisting renal fibrosis and to provide basis of herbal compound in the treatment of renal fibrosis.Мethods Yishen Paidu decoction and Niaoduqing particles were caused by adenine treatment of renal interstitial fiber model Wistar rats, they were divided into six groups: normal group,model group and control group (Ni aoduqing particles), the treatment group (low, medium and high doses). To detect TGF-β1、СolⅣ、SOD. Results Yishen Paidu decoction can reduce levels of TGF-β1, СolⅣ, increased levels of SOD. Сompared with model group, the difference was statistically signi fi cant(P＜0.05). Сonclusion Yishen Paidu decoction had the effect of anti-renal fibrosis in adenine rats．