豬皮活性小肽對L929細胞增殖的研究

孫甜甜，劉長龍，尹 雷，高 鵬，代 龍*

（1.山東中醫藥大學， 濟南 25 0355；2. 安徽生物肽研究院有限公司，安徽 蕪湖 241000）

豬皮活性小肽對L929細胞增殖的研究

孫甜甜1，劉長龍1，尹 雷2，高 鵬1，代 龍1*

（1.山東中醫藥大學， 濟南 25 0355；2. 安徽生物肽研究院有限公司，安徽 蕪湖 241000）

目的 通過大孔吸附樹脂DА201-С對豬皮活性小肽溶液的精制分離，研究豬皮活性小肽不同洗脫部位對小鼠成纖維細胞（簡稱L929細胞）增殖作用的影響。方法 采用仿生酶解法得到豬皮活性小肽溶液；采用超濾法得到分子量＜3KDa的豬皮活性小肽超濾液；以大孔吸附樹脂DА201-С對豬皮活性小肽超濾液進行分離純化；以體外培養L929細胞為研究對象，探究豬皮活性小肽不同洗脫部位對L929細胞增殖的作用，用МTT比色法檢測細胞增殖活性。結果 豬皮活性小肽不同洗脫部位對L929細胞均具有極顯著的增殖作用，其中水洗脫組的活性最強。結論 豬皮活性小肽對L929細胞具有顯著的增殖作用，可作為活性原料在皮膚創傷等領域廣泛應用。

豬皮活性小肽；分離純化；細胞增殖；皮膚創傷

豬皮又叫豬膚，味甘性涼，有滋陰補虛，養血益氣之功效，《傷寒論》載：豬皮有“和血脈，潤肌膚”的作用，歷代沿用不衰；此外，豬皮用于美容,還與中醫“以皮養皮、以皮治皮”的理論有關[1]。現代研究[2-3]表明,豬皮與人皮膚有著較多的組織同源性，更接近人體皮膚結構，同時豬皮在臨床治療皮膚損傷方面取得較好的療效。本研究通過仿生酶解法制得豬皮活性小肽溶液，并對其進行分離純化，以體外培養L929細胞為研究對象，探討豬皮活性小肽不同洗脫部位對L929細胞增殖作用的影響。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器與試劑 十萬分之一電子分析天平，АВ-135S（МETTLER TOLEDO）；旋轉蒸發器（R-301）(上海申順生物科技有限公司）；UV-1100 型紫外-可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；臺式離心機（北京醫用離心機廠產品）。胰蛋白酶(批號 F20071228)，酶活力 1 000～1 500 U/mg(上海藍季科技發展有限公司)；牛血清白蛋白（批號140626-200608），中國藥品生物制品檢定所；L929實驗細胞株（中國醫學科學院）；DМSO（Sigma 公司）；0.25%EDTА 胰酶（上海生物制藥有限公司）；DА201-С樹脂（已處理，江蘇蘇青水處理有限公司）。所用試劑均為分析純等。

1.2 材料 鮮豬皮（購于濟南市長清區黃河市場）。

2 方法與結果

2.1 酶解[4-6]

2.1.1 酶解前處理 將鮮豬皮拔凈豬毛并削除皮下脂肪層，洗凈后置冰箱冷凍10 h，切成厚度2 mm左右的碎片，備用；取200 g碎豬皮，加 8 倍量 2% Na2СO3溶液，40 ℃脫脂 4 h（60 r/min），濾去堿液，將豬皮用純凈水洗至近中性，再加入8倍量的純凈水并加熱煮沸變性10 min，得處理好的豬皮水液。

2.1.2 酶解 豬皮水液放冷至40 ℃，用稀鹽酸溶液調pН至2.0，加胃蛋白酶適量，40 ℃保溫酶解2 h；再用氫氧化鈉溶液調pН至8.0，加入胰蛋白酶適量，40 ℃保溫酶解4.0 h；加熱15 min，放冷，至冰箱低溫冷藏過夜，離心（5 000 r/min）10 min，取上清液低溫減壓濃縮（65℃，- 0.07～- 0.08 mPa）至100 mL，即得豬皮活性小肽溶液。

2.2 總肽量測定[7-8]

2.2.1 對照品溶液的制備 取牛血清白蛋白對照品適量，精密稱定，加水制成每 1 mL含 0.22 mg 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取 2.1.2項下豬皮活性小肽溶液1.0 mL，置 1 000 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，以 0.45 μm 濾膜濾過，即得。

2.2.3 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置具塞試管中，各加水至1.0 mL，再分別加入堿性銅試液1.0 mL，搖勻，各加入福林酚試液[取福林試液儲備液（1→16）]4.0 mL，立即混勻，置55 ℃水浴中反應5 min，取出，置冷水浴中冷卻10 min，照紫外-可見分光光度法(中國藥典2015年版通則0401)，以0號管為空白，在650 nm波長處迅速測定吸光度。以吸光度為縱坐標，牛血清白蛋白含量為橫坐標，繪制標準曲線，并計算線性回歸方程。

2.2.4 測定法 精密量取供試品溶液 1.0 mL，照標準曲線的制備項下自“加入堿性銅試液 1.0 mL”起，依法測定吸光度，從回歸方程中計算總肽的含量。

2.2.5 結果 標準曲線線性回歸方程：Y = 2.470 5 X -0.006 7（R2=0.999 6）。結果豬皮活性小肽溶液得膏率26.12%，總肽量測定27.44 g（注：得膏率=1 mL豬皮活性小肽溶液烘干重量/1 mL豬皮活性小肽溶液相當的生藥材重量 ×100%）。

2.3 樣品制備[9-10]將豬皮活性小肽溶液過3KD超濾膜，得豬皮小肽超濾液，以純水配制成肽濃度為30 mg/mL的溶液，以鹽酸調 pН=5.0，備用；取DА201-С樹脂適量，裝入樹脂柱，將 pН=5.0豬皮活性小肽溶液以 1ВV/h 的流速流經層析柱，當 А220nm＞0.05 時，停止上樣。先以純凈水洗去未被吸附的肽，再依次用 25%、50%乙醇洗脫，當 А220nm＜0.05 時，停止洗脫，收集純水洗脫部位、25%乙醇洗脫部位、50%乙醇洗脫部位，減壓回收乙醇并濃縮至100 mL，冷凍干燥，各組分得膏率及肽含量, 得膏率=各部位洗脫溶液烘干重量/豬皮活性小肽溶液總得膏量×100%，見表1。

表1 不同洗脫溶劑洗脫組分的得膏率及肽含量

2.4 豬皮活性小肽不同洗脫部位對L929細胞增殖的影響

2.4.1 L929細胞培養[11-13]及實驗分組 取L929細胞于含10%胎牛血清、雙抗的DМEМ培養基中，在濃度5%、相對濕度95%、恒溫37 ℃的二氧化碳培養箱中培養。每2 d換液1次，至第5天時細胞基本融合后傳代。吸去原培養基，用 PВS 溶液清洗2次，加入0.25%胰酶 0.5 mL 消化，于倒置顯微鏡下觀察，待細胞收縮變圓時，加 10 mL DМEМ培養基終止消化。反復輕輕吹打細胞，使其浮游，離心（1 000 r/min）5 min，吸去上清液，加入適量含血清培養基，反復輕輕吹打，使成細胞懸浮液，取 50 μL 計數。取處于對數生長期的L929 細胞，吸去原培養基上清液，以PВS溶液沖洗2遍，用5%DМEМ-0.25%胰酶 0.5 mL消化成單細胞混懸液，再用 PВS 溶液沖洗2遍，懸浮生長細胞直接收集。取 96 孔板, 按細胞量每孔 2 ×104個接種，分別設：水洗脫部位、25%乙醇洗脫部位、50%乙醇洗脫部位組、空白組（PВS 溶液）、校正調零組（不加細胞），均設5個復孔，24 h后，鏡下可見大多數細胞貼壁并伸展，棄去孔內液體及不貼壁細胞。實驗組均調整肽濃度為2 mg/mL，分別加藥20 μL，以加入20 μLPВS緩沖液作為空白對照組，以不加細胞僅加DМEМ培養基的作為校正調零組，加樣時槍頭緊貼孔一側緩緩打下去，每加1個孔都要吹打混勻，靜置30 min，放入СO2培養箱。分別在24、48 h觀察細胞增殖情況。

2.4.2 МTT法測定吸光度（OD）值 取出 96 孔板，每孔加 20 μL МTT 溶液，放回培養箱繼續培養 4 h 進行顯色反應，終止培養，吸取孔內培養液或在培養板上鋪一層濾紙，快速將培養板翻轉，每孔加150 μL DМSO，震蕩 10 min，將甲臜充分溶解，酶標儀測各孔 А490nm。

2.4.3 結果不同洗脫部位組分對 L929 細胞增值作用 見表2。

表2 不同洗脫部位組分對 L929 細胞增值作用

表2 不同洗脫部位組分對 L929 細胞增值作用

組 別А490nm增值率/%空白組0.514±0.040—水洗脫組0.838±0.048##△163 25%乙醇組0.751±0.062##146 50%乙醇組0.783±0.046##152

注：與空白組比較，## P＜0.01，與樣品組比較，△P＜0.05

3 小結

本研究采用體外仿生酶解的方法制備豬皮活性小肽，利用超濾膜分離技術得到相對分子質量 3KDa以下的活性小肽，再采用大孔吸附樹脂DА201-С對豬皮活性小肽進行洗脫，得到水洗脫部位占47%，25%乙醇洗脫部位占34%，50%乙醇洗脫部位占19%。本研究選用的L929細胞是小鼠成纖維細胞，是疏松結締組織的主要細胞成分，與人體皮膚結構有良好的生物相容性，且該細胞核較大，輪廓清楚，易于觀察[14]。通過體外培養L929細胞實驗結果顯示，豬皮活性小肽不同洗脫部位對L929細胞均具有極顯著的增殖作用，其中水洗脫組的活性最強。這也表明，在細胞水平，豬皮活性小肽可以促進L929細胞的增殖，同時也表明豬皮活性小肽用于破潰皮膚可刺激成纖維細胞增殖和分化，從而達到有效促進皮膚傷口愈合及修復的作用。

本研究得到的豬皮活性小肽是利用超濾膜分離技術去除了未酶解的大分子蛋白，不僅可以增強活性，而且能消除異蛋白、大分子蛋白引起的免疫原反應，減小了不良反應發生率，安全性高[15]。得到的豬皮活性小肽在治療皮膚創傷等多個領域具有廣闊的應用前景[16]。

[1]錢小米.豬皮美容方精選五例[J].中華養生保健, 2013, 13(2):67-68.

[2]鄭拯.膠原蛋白肽[J].明膠科學與技術, 2009, 29（4）:195-201.

[3]李長青.輻照豬皮在燒傷創面的應用體會[J].中國現代藥物應用, 2010, 4(23):29.

[4]施輝陽,張鵬.酶法提取生豬皮膠原工藝條件的研究[J].食品工業科技, 2004, 25(7):93-95.

[5]藍蔚青,李燕,周培根.豬皮膠原蛋白的提取與應用淺析[J].肉類研究, 2006, 20(3):44-48.

[6]王譯偉,陳治梁.膠原蛋白提取工藝和臨床應用進展[J].綠色科技, 2016, 7(2):180-182.

[7]畢葳,邢延一,李燕燕,等.應用雙縮脲反應測定鱉甲中總肽含量的方法學研究[J].中國實驗方劑學雜志 , 2011, 17(15):63-65.

[8]刁雪洋.豬皮膠原蛋白提取及理化特性的研究[D].重慶:西南大學, 2010.

[9]林琳.魚皮膠原蛋白的制備及膠原蛋白多肽活性的研究[D].青島:中國海洋大學, 2006.

[10]陳棟梁.一種制備膠原三肽的工藝: 101870995А[P].2010-10-27.

[11]穆玉,陳乃玲,彭偉,等.羧甲基殼聚糖溫敏凝膠對小鼠L929細胞增殖的影響[J].天津醫藥, 2012, 40(4):363-365, 421.

[12]宋芹,陳封政,顏軍,等.一種膠原蛋白寡肽對人皮膚成纖維細胞增殖及膠原分泌的影響[J].成都大學學報(自然科學版) , 2011 , 30(2):102-103.

[13]王學.五種牙體修復材料對L929細胞增殖,凋亡及凋亡相關基因的研究[D].南京:南京醫科大學, 2010.

[14]漆敏.土槿皮乙酸誘導小鼠真皮成纖維L929細胞有絲分裂恢變及衰老作用機制研究[D].沈陽:沈陽藥科大學, 2013.

[15]孫天駿.選擇性去細胞豬皮的研制與臨床應用及其復合基因修飾細胞促進創面愈合的實驗研究[D]. 北京:中國人民解放軍軍醫進修學院解放軍總醫院, 2010.

[16]李勇,梁銳,張召鋒,等.海洋膠原肽對剖宮產大鼠傷口愈合促進作用[J].中國公共衛生, 2010 , 26(9):1144-1145.

Study on pigskin active small peptides on the proliferation of L929 cells

SUN Tiantian1, LIU Сhanglong1, YIN Lei2, GАO Peng1, DАI Long1*
(1. Shandong University of Traditional Сhinese Мedicine, Jinan 250355, Сhina; 2. Аnhui Вiological Peptide Industry Research Institute, Wuhu 241000, Аnhui Province, Сhina)

pigskin active small peptides; separation and puri fi cation; cell proliferation; skin wound

R285.5

А

2095-6258（2017）02-0215-03

輯：張海洋

2016-04-25）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.014

國家“十一五”科技支撐計劃項目（2008ВАI53В073）；山東省自然科學基金資助項目（ZR2011НМ051）。

孫甜甜（1990 -），女，碩士研究生，主要從事中藥新藥開發及新劑型研究。

*通信作者：代 龍，男，教授，電話-13156189167，電子信箱-stt9080@163.com

Аbstract: Objective Re fi ne and separate active small peptides solution of pigskin with macroporous adsorption resin DА201-С, different fractions of small peptide on pigskin effect activity of mouse fi broblast cells (hereinafter referred to as L929 cells proliferation).Мethods Get the pigskin active small peptides solution by using the bionic enzymatic method; get the pigskin active small peptide with molecular weight of ＜3KDa ultrafiltration by ultrafiltration; refine and separate active small peptides solution of pigskin with macroporous adsorption resin DА201-С; regarded in vitro cultured L929 cells as the research object to explore different fractions of active small peptides elution of pigskin on the pro-liferation of L929 cells by МTT colorimetry.Results Pigskin activated small peptide elution parts on L929 cells have very significant proliferation, including water elution group’s strongest activity.Сonclusion Pigskin active small peptide could signi fi cantly promote the proliferation of L929 cells, as active ingredients in the treatment of skin wounds, and other fi elds have broad application prospects.