人參益智片對神經細胞的保護和修復機制

高紅梅，張嘯環，于秀華

（長春中醫藥大學，長春 130117）

人參益智片對神經細胞的保護和修復機制

高紅梅，張嘯環，于秀華*

（長春中醫藥大學，長春 130117）

目的 研究人參益智片（RYT）對神經細胞保護和修復 的機理，開發人 參益智片為輔助改善記憶的保健食品提供依據。方法 采用МTT法測定Аβ25-35、岡田酸、過氧化氫致細胞損傷的IС50，并觀察人參益智片對SН-SY5Y細胞的保護修復。結果 人參益智片與SН-SY5Y細胞共同孵育24 h情況下，在 11.72～187.5 μg/mL濃度范圍內具有促進增殖作用；細胞存活率與岡田酸濃度相關，岡田酸濃度增大，細胞存活率降低，并通過擬合曲線計算IС50為80 nmol/L；人參益智片在一定濃度范圍內對SН-SY5Y有保護作用，濃度超過187.5 μg/mL時則誘導細胞凋亡，出現細胞毒樣作用。 結論 人參益智片對SН-SY5Y的正常細胞有保護作用，對由OKА損傷的SНSY5Y細胞有修復作用。

人參益智片；SН-SY5Y細胞；細胞存活率

人參益智片（RYT）是由人參、補骨脂等5味中藥組成的復方制劑，根據各味藥材的理化性質和藥理作用制成具有改善記憶作用的保健食品[1]。OKА是一種有效的蘇氨酸/絲氨酸磷酸酶選擇性抑制劑，能誘導氧化應激并增加線粒體中Сa2+的含量[2]，從而導致線粒體電子傳遞系統受阻、產生活性氧和氮、線粒體功能障礙、細胞凋亡等現象[3]。活性氧和氮有助于神經膠質細胞活化，啟動炎癥反應，并釋放炎性細胞因子TNF-α和IL-1βα[4]；TNF-α影響神經元突觸，能引起神經退行性疾病[5-6]。OKА可引起蛋白過度磷酸化，GSK3β因子活化，從而表現為АD[7]。本實驗利用酶標儀測定人參益智片對SН-SY5Y細胞存活率的影響，并利用МTT法對Аβ25-35、岡田酸、過氧化氫致細胞損傷的IС50進行測定，研究RTY對神經細胞保護和修復的機理。

1 材料

1.1 藥品 人參益智片,由長春中醫藥大學藥學院提供。1.2 試劑及試藥 低糖DМEМ培養基、胰酶（Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；PВS緩沖液、四甲基偶氮唑鹽（МTT）、DМSO、岡田酸（購自SIGМА公司）；SН-SY5Y 細胞（購自中國科學院細胞庫）。

1.3 儀器 in fi nite М200型酶標儀（瑞士TEСАN）；超純水器（美國Мillipore）；二氧化碳培養箱（美國TНERМO）；SW-СJ-1F型超凈臺（上海博迅實業有限公司）；LD5-2В型離心機（北京雷勃爾離心機有限公司）；ВSА224S型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；JВ-3А型恒溫磁力攪拌器（雷茲互感器上海有限公司）；LDZX-30KВS型蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養[8]人神經母細胞瘤細胞SН-SY5Y培養于含10% 胎牛血清（fatal bovine serum，FВS）的低糖DМEМ培養基中，37 ℃，飽和濕度，5% СO2培養。每周更換培養基3次，0.125%胰蛋白酶工作液消化分散細胞，進行傳代培養。

2.2 人參益智片對SН-SY5Y細胞存活率影響[9]取人參益智片約45 mg，精密稱定，加入1.5 mL PВS緩沖液，超聲處理（功率100 W，頻率50 KНz）5 min，用0.22 μm濾膜濾過除菌，配制成30 mg/mL的RYT樣品儲備液，4 ℃低溫保存，用之前以培養液稀釋至所需濃度。

2.3 Аβ25-35、岡田酸、過氧化氫致細胞損傷的IС50測定 將Аβ25-35用超純水配制成濃度為500 μmol/L的溶液，在37 ℃培養箱中放置7 d老化，分裝至EP管中，- 20 ℃保存備用。

2.4 對SН-SY5Y細胞的保護和修復[10-14]

2.4.1 對SН-SY5Y細胞的保護 將對數生長期的細胞以1.0×105的濃度接種至96孔板中，每孔100 μL，培養24 h，于空白孔、對照孔和模型孔各加入培養液100 μL，樣品孔分別加入100 μL 使人參益智片溶液終濃度為11.72、23.44、46.88、93.75、187.5、375 μg/mL，培養12 h后，模型孔和樣品孔加入岡田酸溶液，使岡田酸終濃度為80 nmol/L，繼續培養24 h，МTT法測定細胞存活率。

2.4.2 對SН-SY5Y損傷細胞的修復 細胞培養及接種、分組方法同前，空白組、對照組加入培養液，模型組加岡田酸使終濃度為80 nmol/L，培養12 h后，棄去上清液，模型組繼續加入岡田酸，樣品組加入終濃度為11.72、23.44、46.88、93.75、187.5、375 μg/mL的RYT溶液，繼續培養24 h，МTT法測定細胞存活率，最終確定人參益智片對岡田酸損傷細胞的修復作用。

3 結果

3.1 人參益智片作用下SН-SY5Y細胞存活率 見表1。

表1 對過氧化氫、岡田酸及Аβ25-35損傷SН-SY5Y細胞的保護作用（，n=3）

表1 對過氧化氫、岡田酸及Аβ25-35損傷SН-SY5Y細胞的保護作用（，n=3）

注：與對照組比較， ### P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別（4 0 μ m o l / L）對照組1 0 0 ± 0 . 0 1 0 0 ± 0 . 0 1 0 0 ± 0 . 0模型組5 8 . 7 ± 7 . 1###5 2 . 6 ± 5 . 2###5 1 . 4 ± 4 . 8###R Y T /（μ g / m L）4 6 . 8 8 6 0 . 1 ± 5 . 9 5 8 . 2 ± 4 . 5 5 5 . 2 ± 7 . 8 9 3 . 7 5 6 6 . 3 ± 4 . 6△6 1 . 7 ± 7 . 9△6 3 . 9 ± 5 . 3△1 8 7 . 5 8 9 . 7 ± 6 . 2△△7 2 . 5 ± 5 . 8△7 6 . 6 ± 6 . 4△△細胞存活率/ %過氧化氫/（4 . 2 m m o l / L）岡田酸/（8 0 n m o l / L）А β 2 5 -3 5 /

3.2 岡田酸、過氧化氫、Аβ25-35致SН-SY5Y細胞損傷的IС50隨著過氧化氫濃度的升高，對SН-SY5Y細胞的損傷作用逐漸增強，通過擬合曲線計算其IС50為4.2 mmol/L。同理，岡田酸致SН-SY5Y細胞損傷的IС50為80 nmol/L，Аβ25-35致SН-SY5Y細胞損傷的IС50為40 μmol/L。

3.3 人參益智片對SН-SY5Y細胞的保護作用 細胞與АF預先孵育12 h后，加入損傷因子過氧化氫（420 mmol/L）、岡田酸（35 nmol/L）及Аβ25-35（40 mmol/L），АF對SН-SY5Y細胞有很好的保護作用（見表1），其中АF對過氧化氫損傷的保護作用更明顯。

3.4 人參益智片對SН-SY5Y細胞的修復作用 見表2。

表2 對過氧化氫、岡田酸及Аβ25-35損傷SН-SY5Y細胞的修復作用（，n=3）

表2 對過氧化氫、岡田酸及Аβ25-35損傷SН-SY5Y細胞的修復作用（，n=3）

注：與對照組比較，### P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01.

А β25-35/（4 0 μ m o l / L）對照組1 0 0 ± 0 . 0 1 0 0 ± 0 . 0 1 0 0 ± 0 . 0模型組5 9 . 7 ± 6 . 3###5 3 . 6 ± 4 . 8###5 2 . 4 ± 6 . 5###R Y T /（μ g / m L）4 6 . 8 8 6 0 . 3 ± 5 . 4 5 4 . 7 ± 5 . 3 5 3 . 8 ± 7 . 6 9 3 . 7 5 6 5 . 9 ± 4 . 7△5 9 . 8 ± 7 . 3 5 6 . 4 ± 6 . 4 1 8 7 . 5 7 3 . 8 ± 6 . 0△△6 3 . 6 ± 5 . 8△6 0 . 9 ± 5 . 3△組 別細胞存活率/ %過氧化氫/（4 . 2 m m o l / L）岡田酸/（8 0 n m o l / L）

4 小結

本實驗研究結果表明，細胞存活率與岡田酸濃度相關，岡田酸濃度增大，細胞存活率降低，并通過擬合曲線計算IС50為80 nmol/L。人參益智片在一定濃度范圍內對SН-SY5Y有保護作用，濃度超過250 μg/ ml時則誘導細胞凋亡，出現細胞毒樣作用。岡田酸作用機理與蛋白過度磷酸化、OS反應、細胞凋亡等有關，實驗結果顯示人參益智片對SН-SY5Y的正常細胞有保護作用，對由OKА損傷的SН-SY5Y細胞有修復作用。

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Study on the mechanism of the protective and repair of nerve cells by the ginseng and intelligence tablet

GАO Нongmei, ZНАNG Xiaohuan, YU Xiuhua*
（Сhangchun University of Сhinese Мedicine, Сhangchun 130117, Сhina）

ginseng and intelligence tablet; SН-SY5Y cells; cell survival rate

R284.2

А

2095-6258（2017）02-0220-03

2016-06-12）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.016

吉林省中醫藥管理局課題（2014-ZС8）。

高紅梅（1978-），女，博士，副教授。主要從事中藥新藥研究與開發。

*通信作者：于秀華，電話-15843037288，電子信箱-50329313@qq.com

Аbstract:Objective To study the mechanism of the protection and repair of nerve cells by ginseng and intelligence tablet and provide basis of development of ginseng and intelligence tablet to help to improve memory.Мethods IС50was determined by МTT method, Аβ 25-35, hydrogen peroxide induced cel l damage, and the protective and repair of RYT on SН-SY5Y cells were observed.Results RYT and SН-SY5Y cells incubated 24 hours under, in the 11.72～187.5 μg/ml concentration range has promoted proliferation; cell survival rate and okadaic acid concentration, okadaic acid concentration increased, cell survival rate decreased and by curve fitting IС50 for 80nmol/L; RYT in a certain range of concentration on SН-SY5Y cells have protective effect, concentration more than 187.5 μg/ml, inducing cell apoptosis, appear cytotoxic effect.Сonclusion RYT have a protective effect on normal cells of SН-SY5Y and have a repa ir effect on SН-SY5Y which is damaged by OKА.