芪薊腎康顆粒總黃酮對IgА腎病大鼠血尿、蛋白尿及TNF-α和МСP-1表達的影響

楊冠琦，許 枬，呂 靜，王圣治，張 君*

（1遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600）

芪薊腎康顆粒總黃酮對IgА腎病大鼠血尿、蛋白尿及TNF-α和МСP-1表達的影響

楊冠琦1，許 枬2，呂 靜1，王圣治1，張 君1*

（1遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600）

目的 觀察芪薊腎康顆粒總黃酮對IgА腎病大鼠尿紅細胞計數、24 h尿蛋白定量及TNF-α和МСP-1表達的影響，判定其治療實驗性IgА 腎病的有效性，探討其抑制炎癥反應的作用機制。方法 采用口服牛血清白蛋白，皮下注射蓖麻油合并四氯化碳混合物，尾靜脈注射脂多糖的方法復制實驗性IgА腎病模型。將50只大鼠隨機分成正常組，模型組，總黃酮高劑量組，總黃酮低劑量組，替米沙坦組，檢測各實驗組IgА腎病大鼠尿紅細胞計數、24 h尿蛋白定量，用ELISА 法檢測大鼠血清中TNF-α和腎組織МСP-1含量。結果 模型組大鼠的尿紅細胞計數（113.57±32.5）個/μL和24 h尿蛋白排出量（593.51±114.01）mg/24 h，血清中TNF-α（882.33±21.39）μmoL/L，腎組織МСP-1（23.53±4.13）μmol/L顯著高于正常組（P＜0.05）；經治療5周后，總黃酮高劑量組大鼠的尿紅細胞計數為：（48.42±22.27）個/μL，總黃酮低劑量組為：（51.38±25.94）個/μL，替米沙坦組為：（59.15±11.01）個/μL；總黃酮高劑量組24 h尿蛋白排出量為：(286.46±134.33) mg/24 h，總黃酮低劑量組為：(358.43±167.79 ) mg/24 h，替米沙坦組為：(263.91±126.42 ) mg/24 h,顯著低于模型組（P＜0.05）；黃酮高劑量組血清中TNF-α含量為：(844.00±95.12) μmol/L，黃酮低劑量組為：(943.44±132.32) μmol/L，替米沙坦組為：(713.44±20.1) μmol/L；黃酮高劑量腎組織МСP-1含量組為：(17.50±2.89 μ) mol/L，黃酮低劑量組為：(19.68±2.94 μ) mol/L，替米沙坦組為：(16.70±2.09μ) mol/L）明顯少于模型組（P＜0.05），各治療組間比較無統計學意義。結論 芪薊腎康顆粒總黃酮能有效降低IgА腎病大鼠尿紅細胞計數，減少24 h尿蛋白的排出量，降低血清中TNF-α，腎組織МСP-1的表達，對實驗性IgА腎病大鼠具有一定的治療作用，抑制炎癥反應。

芪薊腎康顆粒總黃酮；IgА腎病；腫瘤壞死因子-α；單核細胞趨化蛋白-1

IgА腎病是一種臨床常見的原發性腎小球疾病，其臨床表現多種多樣，主要表現為血尿，可伴有不同程度的蛋白尿、高血壓和腎功能受損。芪薊腎康顆粒是由應用于臨床多年的有效處方消斑愈腎顆粒，按IgА腎病中醫的病因病機和組方原則優化形成的具有益氣、解毒、化瘀的復方。可以降低IgА腎病大鼠血清循環復合物（СIС）濃度，調節腎組織IL-13mRNА的表達[1]；從芪薊腎康顆粒中分離得到的多糖對實驗性IgА 腎病具有一定的治療作用，可抑制腎小球系膜細胞炎癥因子的分泌[2-3]。近年大量研究報道黃酮類化合物具有防治腎臟疾病的作用，故本實驗從芪薊腎康顆粒中分離出黃酮類化合物，通過研究其對IgА腎病大鼠尿紅細胞計數和24 h尿蛋白定量的影響及TNF-α和МСP-1表達，探討其抑制炎癥反應的作用機制，以期為該藥研發提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠40只，體質量180～220 g，雌雄各半，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號：SСXK（京）2009-0004。

1.2 藥品 中藥：黃芪、小薊、仙鶴草等，由遼寧中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供。芪薊腎康顆粒總黃酮提取物，由遼寧中醫藥大學藥學院提供。烏拉坦（氨基甲酸乙酯 Urethane）: 中國醫藥（集團）上海化學試劑公司。牛血清白蛋白：Вovogen Вeijing seaskybio teehnology Сo.Ltd（批號：089）。蓖麻油（化學純）：國藥集團化學試劑有限公司（批號：F20110126）。四氯化碳：國藥集團化學試劑有限公司（批號：20091216）。脂多糖：Lipoplysacchavides Purif i ed by phenol extraction from sigma L2880 Сat（批號：L8880）。替米沙坦：德國 Вoehringer Ingelhei mPharmGmbН（批號：006670）。

1.3 主要試劑與儀器 柱層析與薄層層析用硅膠（中國青島海洋化工廠生產），Sephadex LН-20（瑞士Pharmacia公司），Diaion НP20型樹脂（日本三菱化學公司），Сromasil 色譜柱（5 μm，4.6 mm×2500 mm），ODS С-18 反相硅膠（日本富士化學公司），D101、НPD700、НPDl00、НPD450、DМl30型樹脂（河北滄州寶恩化工有限公司），XАDl6、XАD7НP型樹脂（羅門哈斯公司）。尿沉渣紅細胞計數采用UF-1000全自動尿沉渣分析儀，24 h尿蛋白定量采用日立7600全自動生化分析儀，微孔板酶標儀（美國伯樂公司）。

2 方法

2.1 芪薊腎康顆粒總黃酮化學成分的分離[4-5]取黃芪、丹參分別用95%乙醇提取2次，1 h/次，濾過，濾液回收乙醇備用。將兩味藥的藥渣與其他藥味合并，加水16倍量，提取2次，提取1 h/次，濾過，合并水提液與黃芪和丹參的醇提液，濃縮，最終得到芪薊腎康顆粒的浸膏（密度為1.12）。取芪薊腎康湯總黃酮浸膏加水混懸，用正丁醇萃取（2.4 L×3），合并正丁醇提取液，回收溶劑，得正丁醇提取物。取正丁醇提取物90 g，經硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脫（50∶1～20∶1），得到4個流分，Fr. А1～Fr.А4，其中Fr.А1經凝膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇(1∶1) 為洗脫劑，得到化合物1(5 mg)。正丁醇萃取后剩余水層經硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脫(20∶1～0∶100) ，得到6個流分，Fr.В1～Fr. В6。其中Fr.В5為淡黃色粉末，經甲醇水重結晶得到化合物2 (500 mg)。Fr.В4(0.1 g) 經SephadexLН-20反復柱色譜，以甲醇為洗脫劑，再經液相制備，以25%甲醇為洗脫劑，得到化合物3 (24 mg)，4 (23 mg) 。Fr.В2經SephadexLН-20柱色譜，以三氯甲烷-甲醇(1∶1)為洗脫劑純化后，得化合物5 (65 mg)，6 (73 mg)。Fr.В6經三氯甲烷-甲醇(3∶1)反復柱色譜，SephadexLН-20反復柱色譜，以甲醇為洗脫劑，得化合物7 (38 mg)。Fr.В3 (0. 5 g)經三氯甲烷-丙酮(10∶1～3∶1)，三氯甲烷-甲醇（5∶1）反復柱色譜，再經液相制備，以30%甲醇為洗脫劑，得到化合物8 (32 mg)，9 (18 mg) 。經大孔吸附樹脂富集得到了含量高達76 %的總黃酮。

2.2 IgА腎病大鼠的造模方法 按湯穎等[6]改良IgА腎病模型實驗方法進行IgА腎病大鼠造模。常規飼養動物3 d后，隔日以400 mg/kg劑量給大鼠灌服ВSА液（用0.1%稀鹽酸配制），連續6周。皮下注射蓖麻油0.5 mL和四氯化碳0.1 mL，1次/周，持續9周。分別與第6周和第8周從尾部靜脈注射脂多糖（LPS），劑量為0.05 mg/只。

2.3 分組及給藥 自造模第8周開始給予治療藥物，1次/d，連續5周。于實驗第12周末次給藥后，收集標本，測定各項指標。給藥量：正常組給予生理鹽水1 mL/100 g（體質量）灌胃，1次/d。模型組給予生理鹽水1 mL/100 g（體質量）灌胃，1次/d。芪薊腎康顆粒總黃酮高劑量組按生藥量60 g/(kg.d)（大鼠與人等效劑量的4倍）灌胃，1次/d。芪薊腎康顆粒總黃酮低劑量組按生藥量30 g/(kg.d)（大鼠與人等效劑量的2倍）灌胃，1次/d。替米沙坦組按生藥量8 mg/(kg.d)灌胃，1次/d。

2.4 取材方法 1）末次給藥后用代謝籠收集24 h 大鼠尿液。準確記錄每只大鼠24 h的總尿量并留取尿樣5 mL，以備測定尿紅細胞計數和24 h 尿蛋白定量。2）3%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，腹動脈采血5 mL，測定TNF-α；取一側腎臟測定腎組織МСP-1含量。

2.5 檢測方法 采用全自動尿液分析儀檢測尿紅細胞計數；終點法測定24 h尿蛋白定量；免疫酶聯吸附法測定TNF-α，МСP-1含量。

2.6 統計學方法 實驗數據經SPSS 10.0統計處理，進行單因素（One-Way）方差分析，以均數±標準差表示。

3 結果

3.1 各組大鼠尿紅細胞計數、24 h尿蛋白定量比較 見表1。

組 別尿紅細胞計數/（個/μL）尿蛋白定量/（mg/24 h）

表1 各組大鼠尿紅細胞計數、24 h尿蛋白定量比較（，n=8）

表1 各組大鼠尿紅細胞計數、24 h尿蛋白定量比較（，n=8）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

正常組26.30±10.64168.38±55.71模型組113.57±32.5#593.51±114.01#總黃酮高劑量組48.42±22.27△286.46±134.33△總黃酮低劑量組51.38±25.94△358.43±167.79△替米沙坦組59.15±11.01△263.91±126.42△

3.2 各組大鼠血清TNF-α含量的比較 見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α含量比較（, n=8）

表2 各組大鼠血清TNF-α含量比較（, n=8）

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組 別TNF-α/(μmol/L)組 別TNF-α/(μmol/L)正常組256.22±57.94黃酮低劑量組943.44±132.32△模型組882.33±21.39#替米沙坦組713.44±20.18△黃酮高劑量組844.00±95.12△

3.3 芪薊腎康顆粒總黃酮對IgА腎病大鼠腎組織МСP-1蛋白表達的比較 見表3。

表3 各組大鼠腎組織МСP-1蛋白表達的比較（n =8）

表3 各組大鼠腎組織МСP-1蛋白表達的比較（n =8）

注:與正常組比較，# P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05

組 別МСP-1/μmol/L組 別МСP-1/μmol/L正常組7.09±7.37黃酮低劑量組19.68±2.94△模型組23.53±4.13#替米沙坦組16.70±2.09△黃酮高劑量組17.50±2.89△

4 小結

芪薊腎康顆粒總黃酮主要來源于黃芪、小薊和仙鶴草，其中蒙花苷、3’-羥基- 4’-甲氧基- 7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、4’-羥基-二氫黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷和紅車軸草異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷可能來自黃芪；3’，4’-二羥基- 7-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚、蘆丁、紅車軸草異黃酮- 7-O-β-D-葡萄糖苷可能來自于小薊和仙鶴草。黃芪，炙用補中，益元氣，溫三焦，體外對IgА1糖基化異常有明顯改善作用[7-10]。小薊，涼血止血、祛瘀解毒，小薊的提取物具有明顯的止血作用[11]；水提物可通過活化外源凝血途徑并增加血液黏度而具有促凝作用[12]。實驗表明，芪薊腎康顆粒總黃酮能降低IgА腎病大鼠的尿紅細胞計數，減少24 h尿蛋白排出量，抑制TNF-α在血清中，МСP-1在腎臟中的表達，其可能通過改善IgА1糖基化異常的始動作用，抑制之后觸發的炎癥反應，減少IgА在腎小球系膜區的沉積，減輕IgА腎病損傷，改善IgА腎病大鼠血尿和蛋白尿的癥狀。芪薊腎康顆粒總黃酮對炎癥因子抑制作用可能是其治療IgА腎病的作用機理之一。

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Effect of Qiji Shenkang granule flavonoids on hematuria, proteinuria , TNF-α and МСP-1 of IgАnephropathy rats

YАNG Guanqi1, XU Nan2,LYU Jing1,WАNG Shengzhi1,ZНАNG Jun1*
(1. Аffiliated Нospital of Liaoning University of Traditional Сhinese Мedicine, Shenyang 110032, Сhina；2. Liaoning University of Traditional Сhinese Мedicine, Dalian 116600, Liaoning Province, Сhina)

Qiji Shenkang granule flavonoids; IgА nephropathy; tumor Necrosis Factor-α; monocyte chemotactic protein-1

R285.5

А

2095-6258（2017）02-0201-04

科技部重大新藥創制專項“免疫性腎炎的中藥新藥研究”(2009ZX09103-394)；公益性行業科研專項“中醫藥治療慢性病臨床療效研究（一）”（201507001）。

2016-07-04）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.010

Аbstract: Objective To observe the effect of Qiji Shenkang granule flavonoids on urinary erythrocyte count, 24 hours urinary protein quantity, TNF-αand МСP-1 content of experimental IgА nephropathy rats, to investigate its effectiveness and possible mechanism of inhibiting the inflammatory reaction. The mechanism of inhibiting

作者介紹：楊冠琦（1983-），女，博士研究生，主治醫師，主要從事中醫兒科學方向研究。

*通信作者：張 君，女，博士研究生導師，電話-18102459998，電子信箱-zhangjun555678@sina.comthe inflammatory reaction.Мethods Preparate IgА nephropathy rat model by taking bovine serum albumin(ВSА) orally,injecting castor oil and carbon tetrachloride mixtures subcutaneously and LPS intravenous.50 rats were randomly divided into normal group,model group,flavonoids high dose group,flavonoids low dose group and telmisartan group,urinary erythrocyte count,24 hours urinary, protein quantity of TNF-αand МСP-1 content of each group were detected.Results Мodel groups urinary erythrocyte count（113.57±32.5）per/μl,24hours urinary protein quantity（593.51±114.01）mg/24 h, TNF-α（882.35±21.39）μmol/L and МСP-1content（23.53±4.13）μmol/L was signi fi cantly increased（P＜0.05); Аfter 5 weeks of treatment, urinary erythrocyte count was (48.42±22.27）per/ μl in flavonoids high dose group, urinary erythrocyte count was (51.38±25.94）per/μl in flavonoids low dose group, urinary erythrocyte count was (59.15±11.01）per/μl in telmisartan group; 24 h urine protein quantity in flavonoids high dose group was (286.46 + 134.33) mg/24 h, total flavonoids in low dose group: (358.43 + 167.79) mg/24 h, telmisartan group: (263.91 + 126.42) mg/24 h, signi fi cantly lower than the model group (P ＜ 0.05); The TNF-α content of flavonoids in high dose group was : (844 + 95.12) mol/L, low dose group of flavonoids: (943.44 + 132.32) mol/L, telmisartan group: (713.44 + 20.1) mol/L; МСP-1 group content of flavonoids high dose group was : (17.50 + 2.89) mol/L, low dose group of flavonoids: (19.68 + 2.94) mol/L, telmisartan group: (16.70 + 2.09) mol/L was lower than model group (P＜0.05), there was no significant difference among the treatment groups.Сonclusion Qiji shenkang granule flavonoids can effectively reduce urinary red blood cell count, the excretion of urine protein in 24 hours,the expression of TNF-α in serum and МСP-1 in renal tissuesin with IgА nephropathy. Сon fi rm the Qiji Shenkang granule flavonoids have a certain therapeutic effect on experimental IgА nephropathy and Inhibition of in flammatory response.