AIH治療失敗后行IVF-ET患者卵泡液中抗精子抗體和抗心磷脂抗體表達(dá)情況及妊娠結(jié)局

徐楗熒，趙雪燕，王磊，楊嫦玉，蔡桂豐

(珠海市婦幼保健院生殖中心，珠海 519000)

AIH治療失敗后行IVF-ET患者卵泡液中抗精子抗體和抗心磷脂抗體表達(dá)情況及妊娠結(jié)局

徐楗熒*，趙雪燕，王磊，楊嫦玉，蔡桂豐

(珠海市婦幼保健院生殖中心，珠海 519000)

目的 探討夫精人工授精(AIH)治療失敗后行IVF-ET患者，卵泡液中抗精子抗體(AsAb)和抗心磷脂抗體(AcAb)表達(dá)情況及妊娠結(jié)局。 方法 回顧性分析2014年1月～10月在我院生殖中心AIH≥3次失敗后行IVF-ET的79個周期，其中30個周期行IVF-ET后無優(yōu)質(zhì)胚胎移植或未妊娠者納入A組，49個周期行IVF-ET后成功妊娠者作為對照B組，比較兩組臨床資料、獲卵、受精及優(yōu)質(zhì)胚胎情況；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測兩組卵泡液中AsAb和AcAb的表達(dá)。 結(jié)果 兩組年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、激素等臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。A組受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)顯著低于B組 (P<0.01)；A組平均獲卵數(shù)和卵裂率低于B組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。卵泡液中AsAb和AcAb在A組陽性率均顯著高于B組(P<0.01)。 結(jié)論 AIH≥3次未妊娠后行IVF-ET卵泡液中AsAb和AcAb陽性表達(dá)，可能影響受精、優(yōu)質(zhì)胚胎形成和胚胎種植生殖環(huán)節(jié)。

夫精人工授精； 體外受精-胚胎移植； 抗精子抗體； 抗心磷脂抗體； 妊娠結(jié)局

(JReprodMed2017，26(4)：341-344)

不孕的病因和機制非常復(fù)雜，近年來有關(guān)免疫與不孕的關(guān)系已引起研究學(xué)者的高度重視，并成為生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點[1]。免疫因子抗精子抗體(antisperm antibodies，AsAb)和抗心磷脂抗體(anticardiolipin antibodies，AcAb)與不孕及流產(chǎn)關(guān)系密切，目前較多臨床研究提示血液和宮頸粘液中AsAb和AcAb陽性表達(dá)導(dǎo)致不孕和孕早期流產(chǎn)[2-6]。但是，卵泡液中AsAb和AcAb表達(dá)情況及與不孕的關(guān)系國內(nèi)外少見報道。本研究回顧性分析反復(fù)夫精人工授精(AIH)治療失敗后行IVF-ET患者79個周期，探討免疫因子AsAb和AcAb表達(dá)情況及妊娠結(jié)局。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2014年1月～10月在我院生殖中心行IVF-ET的79個周期。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往行AIH≥3次失敗；(2)超聲檢查未發(fā)現(xiàn)卵巢囊腫或者行腹腔鏡檢查排除子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)及盆腔粘連；(3)無生殖道及子宮器質(zhì)性疾病，宮腔無病變；(4)既往無家族性特殊病種史，無免疫系統(tǒng)疾病、血液病、血栓性疾病及其他系統(tǒng)疾病史。其中30個周期行IVF-ET后無優(yōu)質(zhì)胚胎移植或未妊娠者納入A組，包括繼發(fā)不孕9個周期，原發(fā)不孕21個周期；49個周期行IVF-ET后成功妊娠者作為對照組(B組)，包括繼發(fā)不孕20個周期，原發(fā)不孕29個周期。根據(jù)男方取卵當(dāng)天取出精子的情況決定受精方式，A組25個周期行常規(guī)IVF，5個周期行卵母細(xì)胞漿單精子注射(ICSI)；B組45個周期行常規(guī)IVF，4個周期行ICSI。病因包括輸卵管因素、多囊卵巢綜合征、排卵障礙、男方少、弱、畸形精子癥等。

二、研究方法

1. 控制性促排卵方案：應(yīng)用長效促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，博福—益普生，法國)長方案降調(diào)節(jié)，月經(jīng)第3天后給予重組卵泡刺激素(rFSH，默克雪蘭諾，德國)和/或尿人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG，廣州麗珠)進(jìn)行控制性促排卵，根據(jù)患者情況及卵泡長勢調(diào)整劑量。兩組患者均于用藥期間行陰道超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育，并測定血清LH、E2及孕酮(P)水平。當(dāng)至少有1個主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm或者2個主導(dǎo)卵泡直徑≥17 mm時，皮下注射重組人絨毛膜促性腺激素(艾澤，默克雪蘭諾，德國)250 μg。

2.取卵及移植：注射重組人絨毛膜促性腺激素后34～36 h陰道超聲引導(dǎo)下行取卵術(shù)。卵母細(xì)胞培養(yǎng)3～6 h后行IVF或者ICSI，受精16～20 h觀察受精卵原核形成情況，孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，定期觀察胚胎卵裂情況，取卵后第3天對胚胎進(jìn)行分級并行胚胎移植。

3. 胚胎分級[7]：根據(jù)卵裂速度、碎片量、卵裂球形態(tài)及均勻度等情況，將胚胎分為四級。A級：胚胎卵裂球呈圓或卵圓形，大小均勻，形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)均勻清晰，透明帶完整，無碎片或碎片<5%；B級：卵裂球形狀略不規(guī)則，大小略不同，胞質(zhì)可有顆粒現(xiàn)象，碎片6%～20%；C級：卵裂球大小明顯不均，可有明顯形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆粒現(xiàn)象，碎片21%～50%，透明帶完整；D級：卵裂球大小嚴(yán)重不均，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆粒現(xiàn)象，碎片>50%。A級和B級胚胎定為優(yōu)質(zhì)胚胎。

4. 妊娠結(jié)局判定：所有患者均于取卵后每天肌注60 mg黃體酮注射液 (湖北制藥)行黃體支持。胚胎移植后第14天測定血清中HCG水平，>50 U/L 者為生化妊娠，繼續(xù)黃體支持。移植后第28～35天行陰道超聲檢查見到胎芽及胎心血管搏動者為臨床妊娠。

5. 標(biāo)本取材：行陰道超聲引導(dǎo)下取卵術(shù)時負(fù)壓抽吸卵泡液10～20 ml，避免血液污染，收集淡黃色卵泡液到無菌管中。室溫靜置10～15 min，每份標(biāo)本分裝兩個無菌管置于-20℃冰箱備用，用于ELISA實驗。

6. ELISA法檢測AsAb和AcAb表達(dá)情況：ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，用于檢測人卵泡液中AsAb和AcAb蛋白表達(dá)，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。應(yīng)用酶標(biāo)儀(iMark型，BIO-RAD公司，美國)以450 nm波長依序測量各孔的吸光度(optical density，OD值)，每個標(biāo)本同批次均設(shè)3個復(fù)孔，計算OD平均值。P/N=標(biāo)本平均OD值/陰性對照OD值，P/N≥2.1為陽性，P/N<2.1為陰性，陰性對照小于0.10時以0.10計算。

7.觀察指標(biāo)：比較兩組患者年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)性激素、啟動日及HCG性激素水平，獲卵及受精情況，妊娠結(jié)局情況，卵泡液中AsAb和AcAb表達(dá)情況比較。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較應(yīng)用t檢驗；計數(shù)資料用百分率表示，兩組間比較應(yīng)用χ2檢驗。檢驗標(biāo)準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組一般情況比較

兩組患者年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、基礎(chǔ)T、啟動日FSH、LH及HCG日LH、E2相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05) (表1)。

二、兩組獲卵及受精情況比較

A組的受精率低于B組，差異有顯著性意義(P<0.01)；A組的平均獲卵數(shù)和卵裂率均低于B組，但差異無統(tǒng)計學(xué)差異 (P>0.05)。A組中9個周期因移植日無優(yōu)質(zhì)胚胎未行移植，其中6個周期因無正常受精而無優(yōu)質(zhì)胚胎，優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)顯著低于B組(P<0.01) (表2)。

三、兩組妊娠結(jié)局情況

A組患者行ET均未妊娠，其中5個周期因移植日卵巢過度刺激綜合征(OHSS)高風(fēng)險、孕酮升高等因素取消新鮮胚胎移植，后行FET未妊娠。B組中10個周期因上述因素未行新鮮胚胎移植，后行FET成功妊娠；2個周期為新鮮胚胎移植周期未成功，后行FET成功妊娠。B組3個周期孕早期流產(chǎn)(占6.12%)，2個周期宮外孕。

四、兩組卵泡液中AsAb和AcAb表達(dá)情況比較

兩組卵泡液中AsAb和AcAb表達(dá)情況比較，A組的AsAb和AcAb 陽性率均高于B組，比較有顯著性差異(P<0.01) (表3)。

表1 兩組一般情況比較(x-±s)

表2 兩組獲卵及受精情況比較 [(x-±s)，%]

注：與A組比較，*P<0.01

討 論

生殖免疫學(xué)是近年來發(fā)展極快的新興學(xué)科，從免疫學(xué)的角度研究生殖過程的各個環(huán)節(jié)，并為生殖醫(yī)學(xué)開拓新的診斷和防治途徑。隨著生殖免疫學(xué)的發(fā)展，研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)患者機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對自身抗原的某些抗體導(dǎo)致不孕。免疫性不孕發(fā)病率波動于5%～79%，血液中及卵泡液中存在各種抗體引起免疫紊亂，導(dǎo)致精子與卵母細(xì)胞受精、配子形成、胚胎發(fā)育及著床等各個環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，可能是引起不孕的原因[8-10]。

在免疫性不孕中，最常見的是AsAb所導(dǎo)致的生殖障礙[11]。抗精子抗體主要生物學(xué)效應(yīng)[12]：妨礙精子正常發(fā)生；干擾精子獲能和頂體反應(yīng)；引起精子凝集與制動；發(fā)揮細(xì)胞毒性作用；抑制精子穿透宮頸粘液；限制精子與卵母細(xì)胞粘附；阻止精子與卵母細(xì)胞結(jié)合并干擾受精過程；干擾胚胎著床并影響胚胎存活。精子獲能過程涉及精子膜蛋白磷酸化和脂質(zhì)再分布。頂體反應(yīng)是精子膜與外頂體膜融合，使頂體素和透明質(zhì)酸酶等頂體內(nèi)容物暴露的胞吐過程。卵泡液中AsAb能夠阻止精子與透明帶結(jié)合，抑制頂體反應(yīng)[13]。但是，血液及卵泡液中AsAb是否與IVF-ET妊娠結(jié)局有關(guān)尚存在爭議[14]。本研究通過檢測反復(fù)AIH失敗患者行IVF-ET后卵泡液中AsAb表達(dá)情況，提示AsAb陽性表達(dá)的患者受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率均降低。受精過程涉及精子與卵丘細(xì)胞的相互作用、精子與卵透明帶的初級結(jié)合、次級結(jié)合以及精子與卵細(xì)胞膜的結(jié)合。頂體透明質(zhì)酸酶能分解卵丘的基質(zhì)，促進(jìn)精子穿透卵丘，同時能增加精子Ca2+，使精子對其后卵透明帶誘發(fā)的頂體反應(yīng)更敏感。精子與透明帶的結(jié)合涉及特異性蛋白或糖的相互作用。抗精子抗體能阻斷上述過程，從而影響受精。

表3 兩組卵泡液中AsAb和AcAb表達(dá)情況比較(%)

注：與A組比較，*P<0.01

自身免疫是指機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對自身抗原和(或)自身致敏性淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。如果自身抗體或自身致敏性淋巴細(xì)胞攻擊自身組織、細(xì)胞導(dǎo)致其產(chǎn)生病理改變和功能障礙時即為病理性自身免疫。抗磷脂抗體是一組針對各種帶有負(fù)電荷的磷脂及其結(jié)合蛋白成分而產(chǎn)生的自身免疫抗體，主要有AcAb。AcAb通過抑制細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞分化為合體滋養(yǎng)細(xì)胞使胎盤β-HCG合成和分泌減少，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞增殖，減弱滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕能力，干擾子宮螺旋動脈血管重鑄等方面影響胚胎著床及種植。有研究顯示，AcAb抗體陽性者其IVF-ET周期妊娠率及胚胎種植率下降[15]。本研究顯示，反復(fù)AIH失敗患者行IVF-ET后，無優(yōu)質(zhì)胚胎移植或未妊娠者卵泡液中AcAb抗體陽性率為36.7%，行ET或者FET成功妊娠者卵泡液中AcAb抗體陽性率為10.2%。無優(yōu)質(zhì)胚胎移植或未妊娠者卵泡液中AcAb抗體陽性率顯著高于成功妊娠者，比較有顯著性差異(P<0.01)。反復(fù)AIH失敗患者行IVF-ET卵泡液中AsAb和AcAb陽性表達(dá)，可能影響受精、優(yōu)質(zhì)胚胎形成和胚胎種植生殖環(huán)節(jié)。

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[編輯：郭永]

Relationship between pregnancy outcome and expression of AsAb and AcAb in follicular fluid in IVF-ET patient after AIH failure

XUJian-Ying*，ZHAOXue-Yan，WANGLei，YANGChang-Yu，CAIGui-Feng

ZhuhaiMaternalandChildren’sHospitalandHealthInstitute，Zhuhai519000

Objective：To investigate the relationship between pregnancy outcome and the expression of antisperm antibodies (AsAb)and anticardiolipin antibodies (AcAb) in follicular fluid in the IVF-ET patients after the failure of assisted insemination with husband sperm (AIH).Methods：The data of 79 IVF-ET cycles of infertile patients after ≥ 3 times of AIH failure in the reproductive medical centre of our hospital from Jan. to Oct. 2014 were analyzed. Thirty cycles had no high-quality embryos transfer or no pregnancy in group A，and 49 cycles had successful pregnancy in group B. The clinical data，number of oocytes retrieved，fertilization rate and number of high-quality embryos were compared between the two groups. The expressions of AsAb and AcAb protein in follicular fluid were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and compared between the two groups.Results：There was no statistically differences in age，duration of infertility，body mass index (BMI) and hormone levels (P>0.05). The fertilization rate and high-quality embryo number in group A were significantly lower than those in group B (P<0.01). The number of oocytes retrieved and cleavage rate were lower in group A than those in group B，but the differences were not significant (P>0.05). The positive rates of AsAb and AcAb in group A were significantly higher than those in group B (P<0.01).Conclusions：The positive expression of AsAb and AcAb in follicular fluid had negative effects on the fertilization，formation of high-quality embryo and embryo implantation in IVF-ET patients after ≥ 3 times of AIH failure.

AIH； IVF-ET； AsAb； AcAb； Pregnancy outcome

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.010

2016-09-09；

2016-11-12

珠海市衛(wèi)生局科研項目(項目編號：2014018)

徐楗熒，女，山東人，博士，副主任醫(yī)師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*

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