人臍帶間充質干細胞移植對大鼠流產模型妊娠結局的影響

陳肖靜，楊曉清，陳薇薇，吳榮榮，謝繪繪，張玉泉*

(1.南通大學附屬醫院，南通 226000；2.南通市腫瘤醫院，南通 226361；3.重慶醫科大學附屬第三醫院，重慶 401120)

·實驗研究·

人臍帶間充質干細胞移植對大鼠流產模型妊娠結局的影響

陳肖靜1.2，楊曉清1，陳薇薇3，吳榮榮1，謝繪繪1，張玉泉1*

(1.南通大學附屬醫院，南通 226000；2.南通市腫瘤醫院，南通 226361；3.重慶醫科大學附屬第三醫院，重慶 401120)

目的 探討人臍帶間充質干細胞(WJ-MSCs)移植對大鼠流產模型妊娠結局的影響及機制。 方法 將48只孕鼠隨機分為6組，每組8只。生理鹽水對照組(a)：孕6～8 d皮下注射生理鹽水0.4 mg·kg-1·d-1，孕9 d尾靜脈注射生理鹽水1 ml/kg；乙醇對照組(b)：孕6～8 d皮下注射75%乙醇0.4 mg·kg-1·d-1，孕9 d尾靜脈注射生理鹽水1 ml/kg；流產模型組(c)：孕6～8 d皮下注射溴隱亭0.4 mg·kg-1·d-1，孕9 d尾靜脈注射生理鹽水1 ml/kg；實驗組d1、d2、d3分別于孕6～8 d皮下注射溴隱亭0.4 mg·kg-1·d-1，孕9 d尾靜脈注射WJ-MSCs 1×105個、1×106個、1×107個(生理鹽水使用量為1 ml/kg，將細胞制成混懸液后注射)。各組大鼠均于孕14 d處死并取材，觀察各組大鼠胚胎吸收率，RT-PCR檢測蛻膜組織白介素-10(IL-10)、干擾素-γ(IFN-γ)和IL-17 mRNA的相對表達量。ELISA檢測各組外周血IL-10、IFN-γ和 IL-17的含量。 結果 c組和d1組的平均胚胎吸收數和平均胚胎吸收率均顯著高于a、b、d2、d3組(P<0.05)。c組、d1組與a、b、d2、d3組比較，IL-10 mRNA表達顯著降低(P<0.05)，IFN-γ和IL-17 mRNA表達顯著升高(P<0.05)。c組、d1組與a、b、d2、d3組比較外周血IL-10含量顯著降低(P<0.05)，IFN-γ和IL-17含量顯著升高(P<0.05)。c組與d1組間，a、b組與d2、d3組間的觀察指標比較均無顯著性差異(P>0.05)。 結論 一定濃度的WJ-MSCs移植入大鼠流產模型體內，可以降低胚胎吸收率，改善大鼠流產模型的妊娠結局；其機制可能與WJ-MSCs上調IL-10、下調IFN-γ和 IL-17的含量有關。

流產； 大鼠； Th1/Th2/Th17細胞亞群； 人臍帶間充質干細胞

(JReprodMed2017，26(4)：366-371)

復發性自然流產(RSA)，指同一性伴侶連續或不連續發生兩次及以上的自然流產[1-2]。RSA的病因復雜，目前認為與遺傳因素、內分泌因素、感染因素、內生殖器解剖異常及免疫因素等有關，其中對免疫因素與RSA關系的研究已成為國內外學者們研究的熱點。目前許多對輔助性T細胞(Th)的研究證實，正常妊娠表現為Th2現象，處于Th1抑制狀態，Th1型細胞因子過度表達可導致妊娠丟失，Th1/Th2型細胞因子平衡向Th1偏移與原因不明復發性自然流產(URSA)密切相關[3]。近幾年有研究發現一類新的CD4+T亞群Th17，其主要分泌白介素-17(IL-17)，在胚胎著床及滋養細胞浸潤的過程中起著重要作用[4]，且作為促炎因子的Th17含量升高可以導致自然流產的發生[5]。間充質干細胞(MSC)是一類多能干細胞，研究表明，它可用于類風濕性關節炎、實驗性自身免疫性腦脊髓炎[6-7]和移植物抗宿主疾病[8]等的治療。臍帶間充質干細胞(WJ-MSCs)是一種新型的種子細胞，其來源廣泛、取材容易、易于培養，還具有免疫原性低、能分泌大量細胞因子及無致瘤性[9]、不受倫理限制等優點，因此，WJ-MSCs被認為是成體干細胞的重要來源并且已經成為干細胞研究領域的熱點。

本研究將不同濃度WJ-MSCs應用于溴隱亭致大鼠流產模型[10]，通過觀察不同濃度人WJ-MSCs對妊娠結局的影響，探討自然流產的發生機制，為其應用于自然流產的臨床治療提供實驗依據及新思路。

材料與方法

一、研究對象及主要試劑

1.實驗動物：SD雌性大鼠48只(250～300 g)及成熟SD雄性大鼠(均由南通大學動物實驗中心提供)，用于建立溴隱亭致大鼠流產模型。

2. 主要試劑：溴隱亭(sigma，美國)溶于75%的酒精，濃度為0.4 mg/ml；人WJ-MSCs P1代，由江蘇省領航干細胞公司饋贈。Trizol 試劑盒(Taraka，上海)，RT-PCR成套試劑盒(Taraka，上海)，IL-10、干擾素-γ(IFN-γ)和IL-17引物均由上海生物工程公司合成。IL-10、IFN-γ及IL-17 ELISA試劑盒(eBio-science，美國)。

二、研究方法

1. 動物分組和模型制作[10]：取SD雌性大鼠(250～300 g)和成熟雄性SD大鼠，適應性飼養1 w后，每天于晚18時雌雄1∶1合籠，第2天早晨8點檢栓，觀察到陰道栓者定為孕第1天。均成功受孕后，將48只孕鼠隨機分為6組：生理鹽水對照組(a)：孕6～8 d皮下注射生理鹽水0.4 mg·kg-1·d-1，孕9 d尾靜脈注射生理鹽水1 ml/kg；乙醇對照組(b)：孕6～8 d皮下注射75%乙醇0.4 mg·kg-1·d-1，孕9 d尾靜脈注射生理鹽水1 ml/kg；流產模型組(c)：孕6～8 d皮下注射溴隱亭0.4 mg·kg-1·d-1，孕9 d尾靜脈注射生理鹽水1 ml/kg。實驗組d1、d2、d3分別于孕6～8 d皮下注射溴隱亭0.4 mg·kg-1·d-1，孕9 d尾靜脈注射WJ-MSCs 1×105個、1×106個、1×107個(生理鹽水使用量為1 ml/kg，將細胞制成混懸液后尾靜脈注射移植)。

2. 實驗取材及檢測方法：各組大鼠于孕14 d，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(劑量為0.8 ml/只)，打開胸、腹腔，抽取各組腹主動脈血，置于室溫下30 min，待血液凝固后，置離心機1 000 rmp離心10 min，吸取上層血清，置-20℃冰箱備用。然后暴露子宮，觀察妊娠結局，計數各組胚胎吸收情況，并進行實驗取材。胚胎吸收的判定方法：胚胎完全吸收接近未孕狀態或胚胎體積縮小，胚胎-胎盤單位有明顯淤血、組織變性或壞死，觀察到此現象計為胚胎吸收。胚胎吸收率計算：胚胎吸收率=胚胎吸收數/(胚胎吸收數+未吸收胚胎數)×100%。標本處理方法：將胚胎從子宮剝離，胚胎-胎盤單位連同蛻膜用生理鹽水漂洗后，將新鮮組織直接放入凍存管，置于-80℃冰箱備用；RT-PCR檢測胎盤蛻膜組織的IL-10、IFN-γ和IL-17 mRNA相對表達量。ELISA方法檢測各組大鼠外周血IL-10、IFN-γ和 IL-17的含量變化。檢測均按試劑盒說明書進行操作，進行逆轉錄反應的引物序列見表1。

表1 IL-10、IFN-γ和IL-17 mRNA引物序列

三、統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，所得結果計數資料組間比較采用χ2檢驗，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、成功復制溴隱亭致大鼠流產模型

通過實驗可以觀察到，在皮下注射溴隱亭后，成功導致孕鼠流產，表現為明顯的陰道流血，部分胚胎完全吸收接近未孕狀態，或胚胎體積縮小，胚胎-胎盤單位有明顯淤血、組織變性或壞死。對照組則無陰道流血，胚胎大小均一，呈串珠狀，淡粉色。提示溴隱亭致大鼠流產模型的復制是成功的。

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二、大體觀察各組妊娠結局

a組和b組胚胎大小均一，呈串珠狀，淡粉色；d2、d3組與a、b組大體觀察相同；c組部分胚胎完全吸收接近未孕狀態或胚胎體積縮小，胚胎-胎盤單位有明顯淤血、組織變性或壞死，即為流產胚胎，部分胚胎大體觀察同對照組；d1組大體觀察與流產模型c組沒有區別(圖1)。

三、計數各組胚胎吸收情況

c組和d1組的平均胚胎吸收數和平均胚胎吸收率均顯著高于a、b、d2、d3組(P<0.05)，而c組與d1組間，a、b組與d2、d3組間的平均胚胎吸收數和平均胚胎吸收率均無顯著性差異(P>0.05)；各組平均胚胎數之間差異不具有統計學意義(P>0.05)(表2)。

四、PCR檢測各組IL-10、IFN-γ和IL-17 mRNA表達水平比較

五、ELISA檢測各組外周血IL-10、IFN-γ和IL-17的含量

c組和d1組與a、b、d2、d3組比較外周血IL-10含量顯著降低(P<0.05)，外周血IFN-γ和IL-17含量顯著升高(P<0.05)。3種因子在c組與d1組間，a、b組與d2、d3組間含量比較無顯著性差異(P均>0.05)(表3)。

a：生理鹽水對照組；b：乙醇對照組；c：流產模型組；d1、d2、d3分別為實驗1組、2組、3組圖1 孕14 d時大體觀察各組妊娠結局

組別例數平均胚胎數(個)平均胚胎吸收數(個)平均胚胎吸收率a81188±155075±071?616?b81238±141088±064?731?c81275±139588±0994623d181175±104513±0084361d281200±120125±089?1031?d381150±120138±052?1221?

注：與c組、d1組比較，*P<0.05

a：生理鹽水對照組；b：乙醇對照組；c：流產模型組；d1、d2、d3分別為實驗1組、2組、3組。與c組、d1組比較，*P<0.05圖2 各組IL-10、IFN-γ和 IL-17 mRNA相對表達量比較

表3 各組外周血IL-10、IFN-γ和 IL-17的含量(x-±s)

注：與c組、d1組比較，*P<0.05

討 論

研究認為，在妊娠過程中，母胎界面的子宮蛻膜局部聚集了多種免疫活性細胞，它們分別產生的不同細胞因子發揮著各自不同作用，母體免疫系統對胚胎具有免疫營養和免疫防護作用，其與胚胎源性抗原之間的免疫平衡狀態是胚胎正常生存的必要條件，一旦這種平衡遭到破壞，可導致RSA的發生[11]。研究表明溴隱亭致大鼠流產模型的發病過程中，血清催乳素(PRL)和孕激素濃度的降低與臨床上黃體功能不足相似，且具有Th1/Th2平衡偏向 Th1型反應等特點，易導致流產的發生[10]，為實驗研究自然流產提供理論依據。本實驗通過觀察各組胚胎吸收情況，在皮下注射溴隱亭后，部分胚胎完全吸收接近未孕狀態，或胚胎體積縮小，胚胎-胎盤單位有明顯淤血、組織變性或壞死；對照組則胚胎大小均一，呈串珠狀，淡粉色，表明復制溴隱亭致大鼠流產模型是成功的。

Th1型細胞因子包括IFN-γ、IL-2等，其可以介導細胞免疫，產生細胞毒作用，排斥胚胎組織，引起流產。研究表明，IFN-γ可以減少母胎界面凋亡細胞數量，破壞胎盤結構，使母體蛻膜淋巴細胞易于進入胎兒并發揮其細胞毒作用；IFN-γ還可以下調妊娠過程中轉化生長因子-β1(TGF-β1)表達，影響細胞因子的生物學功能，從而影響滋養層對子宮的入侵[12]。有實驗研究將Th1型細胞因子IFN-γ和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)注射入孕鼠體內，可導致流產發生[13]。Th2型細胞因子主要包括IL-4、IL-5、IL-10等，有保護胚胎的作用。RSA患者體內循環系統中IL-10的低水平表達及早孕絨毛組織滋養細胞表面IL-10表達下降，可能使得細胞免疫增強，滋養細胞植入異常，胎盤淺著床，影響胚胎發育，導致早期自然流產[14-15]。IL-17是T淋巴細胞誘導的炎癥反應的啟動因素之一。它是由活化的CD4+CD45RO+記憶T淋巴細胞(即Th17細胞)產生的一種前炎癥細胞因子[16]。近幾年研究表明Th17細胞作為1種促炎因子，其升高將會導致流產的發生。外周血Th1偏移現象與產生IL-17的T細胞水平是一致的，Th1/Th2向Th1偏移，IL-17數量增加引起免疫炎癥反應這些都是RSA發生的促進因素[17]。

本實驗檢測了IFN-γ、IL-10、IL-17在母胎界面蛻膜組織及外周血的含量。流產模型組(c組)IL-10的含量較生理鹽水對照組(a組)及乙醇對照組(b組)顯著降低，IFN-γ含量較對照組顯著升高(P<0.05)。表明流產模型體內Th1型細胞因子IFN-γ濃度顯著增高，而正常妊娠期母體Th2型細胞因子IL-10顯著增高，Th1型細胞炎性免疫反應對妊娠不利。另外本實驗也檢測了母胎界面及外周血IL-17的含量，流產模型組IL-17的含量較兩對照組顯著升高(P<0.05)。本實驗結果與之前文獻報道[13-14，17]相似。

WJ-MSCs已經成為MSC的重要來源，其獨特的免疫學特性使其在免疫性疾病治療領域具有廣泛的應用前景。Aggarwal等[18]通過MSC與提純的各種免疫細胞共培養，發現其能減少Th1細胞分泌IFN-γ，促進Th2分泌IL-4。體外研究顯示，MSCs可誘導外周淋巴系統Treg細胞分化和增殖，后者可抑制Th17細胞的分化和功能[19]。在體內研究中，MSC可抑制Th17細胞活性，減少IL-17表達和中樞神經系統炎細胞浸潤[20]。在有關膠原誘導性關節炎的研究中，MSCs可通過抑制Th17細胞功能減輕關節炎癥狀[21]。以上研究表明人WJ-MSCs對T細胞具有免疫調節作用。

本實驗中，將WJ-MSCs移植入流產大鼠模型體內，通過大體觀察，發現WJ-MSCs移植入流產大鼠模型且當移植細胞達到一定濃度時可以減少胚胎丟失率，改善妊娠結局；且IL-10在母胎界面及外周血的含量較流產模型組顯著升高，IFN-γ及IL-17含量較流產模型組顯著降低(P<0.05)。本實驗結果表明WJ-MSCs改善妊娠結局的機制可能與通過改變Th1/Th2因子平衡狀態，降低IL-17的含量有關。但其具體是通過自分泌細胞因子還是旁分泌作用以及是否有其他因子參與這一免疫調節過程等尚需進一步研究。本實驗將WJ-MSCs應用于自然流產動物模型是一種新的治療方法，為其應用于臨床提供了實驗依據和新的思路。

[1] Jurkovic D，Overton C，Bender-Atik R. Diagnosis and management of first trimester miscarriage[J]. BMJ，2013，346： f3676.

[2] 肖世金，趙愛民.復發性流產病因學研究進展[J]. 中國實用婦科與產科雜志，2014，30：41-45.

[3] Jin LP，Fan DX，Zhang T，et al. The costimulatory signal upregulation is associated with Th1 bias at the maternal-fetal interface in human miscarriage[J]. Am J Reprod Immunol，2011，66：270-278.

[4] Muzzio DO，Soldati R，Rolle L，et al. B-1a B cells regulate T cell differentiation associated with pregnancy disturbances[J]. Front Immunol，2014，5：6.

[5] Pongcharoen S，Supalap K. Interleukin-17 increased progesterone secretion by JEG-3 human choriocarcinoma cells[J]. Am J Reprod Immunol，2009，61： 261-264.

[6] Hu J，Li H，Chi G，et al. IL-1RA gene-transfected bone marrow-derived mesenchymal stem cells in APA microcapsules could alleviate rheumatoid arthritis[J]. Int J Clin Exp Med，2015，8： 706-713.

[7] Glenn JD，Smith MD，Calabresi PA，et al. Mesenchymal stem cells differentially modulate effector CD8+T cell subsets and exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Stem Cells，2014，32： 2744-2755.

[8] Amorin B，Alegretti AP，Valim V，et al. Mesenchymal stem cell therapy and acute graft-versus-host disease： a review[J]. Hum Cell，2014，27： 137-150.

[9] Subramanian A，Shu-Uin G，Kae-Siang N，et al. Human umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells do not transform to tumor-associated fibroblasts in the presence of breast and ovarian cancer cells unlike bone marrow mesenchymal stem cells[J]. J Cell Biochem，2012，113：1886-1895.

[10] Cummings AM，Perreault SD，Harris ST. Use of bromoergocryptine in the validation of protocols for the assessment of mechanisms of early pregnancy loss in the rat[J]. Fundam Appl Toxicol，1991，17： 563-574.

[11] Lima PD，Zhang J，Dunk C，et al. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy[J]. Cell Mol Immunol，2014，11： 522-537.

[12] Liu Z，Chen Y，Yang Y，et al. The effect on MHC class II expression and apoptosisin placenta by IFNgamma administration[J]. Contraception，2002，65：177-184.

[13] Daher S，de Arruda Geraldes Denardi K，Blotta MH，et al. Cytokines in recurrent pregnancy loss[J]. J Reprod Immunol，2004，62：151-157.

[14] 王振榮，劉娜，杜潘艷，等. 反復自然流產患者外周血白介素水平變化檢測的意義[J].中國婦幼保健，2013，28：1932-1933.

[15] 閆華，劉慈，楊素娟，等. 原因不明反復自然流產患者主動免疫治療前后血清白細胞介素-10、巨噬細胞集落刺激因子白血病抑制因子濃度的變化[J]. 生殖醫學雜志，2006，15： 22-25.

[16] Behr L，Hekmati M，Fromont G，et al. Intra renal arterial injection of autologous mesenchymal stem cells in an ovine model in the postisehemic kidney[J]. Nephron Physiol，2007，107：65-76.

[17] Lee SK，Kim JY，Hur SE，et al. An imbalance in interleukin-17-producing T and Foxp3+regulatory T cells in women with idiopathic recurrent pregnancy loss[J]. Hum Reprod，2011，26：2964-2971.

[18] Aggarwal S，Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses[J]. Blood，2005，105：1815-1822.

[19] Obermajer N，Popp FC，Soeder Y，et al. Conversion of Th17 into IL-17A(neg) regulatory T cells： a novel mechanism in prolonged allograft survival promoted by mesenchymal stem cell-supported minimized immunosuppressive therapy[J]. J Immunol，2014，193：4988-4999.

[20] Kurte M，Bravo-Alegría J，Torres A，et al. Intravenous administration of bone marrow-derived mesenchymal stem cells induces a switch from classical to atypical symptoms in experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Stem Cells Int，2015，2015：140170. doi： 10.1155/2015/140170.

[21] Park MJ，Park HS，Cho ML，et al. Transforming growth factor β-transduced mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune arthritis through reciprocal regulation of Treg/Th17 cells and osteoclastogenesis[J]. Arthritis Rheum，2011，63： 1668-1680.

[編輯：郭永]

Effect of transplantation of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells on pregnancy outcome in rats of abortion model

CHENXiao-jing1，2，YANGXiao-qing1，GHENWei-wei3，WURong-rong1，XIEHui-hui1，ZHANGYu-quan1*

1.TheAffiliatedHospitalofNantongUniversity，Nantong226000 2.DepartmentofGynecology，TumorHospitalofNantong，Nantong226361 3.DepartmentofSocialSecurity，MedicalUniversityofChongqing，Chongqing401120

Objective：To investigate the effect of transplantation of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells (WJ-MSCs) on the pregnancy outcome in the rats of abortion model.Methods：Forty eight pregnancy rats were divided into six groups and eight for each group： the rats were given subcutaneous injection of saline (0.4 mg·kg-1·d-1) from the 6thto 8thof pregnancy，and tail intravenous injection of saline (1 ml/kg) on the 9thday of pregnancy in saline control group (group a)；the rats were given subcutaneous injection of 75% ethanol (0.4 mg·kg-1·d-1) from the 6thto 8thof pregnancy，and tail intravenous injection of saline (1 ml/kg) on the 9thday in ethanol control group (group b)；the rats were given subcutaneous injection of bromocriptine (0.4 mg·kg-1·d-1) from the 6thto 8thof pregnancy，and tail intravenous injection of saline (1 ml/kg) on the 9thday in miscarriage model group (group c)；the rats given subcutaneous injection of bromocriptine (0.4 mg·kg-1·d-1) from the 6thto 8thof pregnancy，and tail intravenous injection of 1×105，1×106and 1×107WJ-MSCs respectively in group d1，d2 and d3 respectively. All the rats were killed and collected the tissue materials at the 14thgestation days. The embryo resorption rate was observed in every group. The mRNA expression of interleukin (IL)-10，interferon-γ (IFN-γ) and IL-17 in the decidual tissues were detected by RT-PCR. The levels of IL-10，IFN-γ and IL-17 in peripheral blood were detected by ELISA.Results：Embryos absorption rate in group c and group d1 was significantly higher than that in group a，b，d2 & d3 (P<0.05). The mRNA expression of IL-10 was significantly decreased，but mRNA expressions of IFN-γ和IL-17 were significantly increased in group C & d1 compared with group a，b，d2 & d3 (P<0.05). The IL-10 level was significantly decreased and IFN-γ & IL-17 levels were significantly increased in peripheral blood in group c & d1 compared with group a，b，d2 & d3 (P<0.05). There were no significant differences in the observation index between group c and d1，group a，b and group d2，d3 (P>0.05).Conclusions：Transplanting certain amount of WJ-MSCs into the rats of abortion model may reduce the embryo absorptivity，and improve the outcome of pregnancy. The mechanism maybe related with WJ-MSCs up-regulating the expression of IL-10 and down-regulating the expression of IFN-γ and IL-17.

Abortion； Rat； Th1/Th2/Th17 cell subsets； Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.015

2016-08-03；

2016-11-12

國家青年自然科學基金資助項目(81401272)；江蘇省婦幼保健重點資助項目(F201312)

陳肖靜，女，江蘇南通人，碩士，住院醫師，婦科腫瘤及生殖醫學方向.(*

，Email：470278241@qq.com)