糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態模型的建立*

李海洋，覃海知，晁 俊，方傳明，富曉旭，高 泓，謝春光△

(1．成都中醫藥大學臨床醫學院，成都 610075; 2．成都中醫藥大學附屬醫院，成都 610075)

【實驗研究】

糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態模型的建立*

李海洋1，覃海知1，晁 俊1，方傳明1，富曉旭1，高 泓2，謝春光2△

(1．成都中醫藥大學臨床醫學院，成都 610075; 2．成都中醫藥大學附屬醫院，成都 610075)

目的:建立糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態模型。方法:60只雄性GK大鼠(隨機血糖>11.1 mmol·L-1)，按隨機數字表法分為GK組、模型組、中藥組各20只，另設正常Wistar大鼠20只為正常組。正常組、GK組喂飼普通飼料，模型組和中藥組喂飼高脂飼料，造模同時中藥組給予益氣養陰中藥治療。5周后檢測各組大鼠糖脂代謝、胰島素抵抗指數(HOMA- IR)、血管內皮細胞凋亡和 Caspase-3表達等指標，光鏡下觀測大血管組織病理。結果:與正常組和GK組比較，模型組大鼠血糖、TC和TG、胰島素抵抗、大血管內皮細胞凋亡和腹主動脈病理比較差異有統計學意義,與模型組比較中藥組所有指標均有顯著改善。結論:通過GK大鼠喂養高脂飼料的方法可制備糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態動物模型。

糖尿病大血管病變；氣陰兩虛；動物模型

糖尿病大血管病變指由糖尿病并發的心、腦及外周血管病變,占糖尿病患者死亡原因的 60%～70%，已經成為我國糖尿病發病率和致死率最高且危害最大的慢性并發癥[1]。為方便實驗研究，筆者采用高脂飼料喂養自發性2型糖尿病大鼠的方法，試圖建立與臨床相吻合的2型糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態模型并對其進行評價。

1 材料與方法

1．1 動物及飼料

SPF級空腹血糖≥11.1 mmol/L的10周齡雄性自發性2 型糖尿病GK大鼠，由中國科學院上海實驗動物中心提供。高脂飼料配方由普通飼料88.2%、精煉豬油 10%、膽固醇1.5%、豬膽鹽0.3%組成,四川省中醫藥科學院實驗動物中心制成塊料。

1．2 藥物及試劑、儀器

參芪復方浸膏由人參、黃芪、生地黃、天花粉、山茱萸、山藥等中藥組成，1 g浸膏相當于原生藥10 g,由四川省中醫藥研究院中醫研究所藥劑科生產(批號080928)。強生穩豪倍優血糖儀和血糖試紙為強生(中國)醫療器械有限公司產品;血清胰島素試劑盒購自北京北方生物技術研究所；甘油三酯和膽固醇試劑盒購自溫州東鷗津瑪生物科技有限公司；實驗動物飲用水處理MF-RO-5型,杭州永潔達凈化科技有限公司產品；7170型全自動生化分析儀,日本日立公司生產；原位細胞凋亡TUNEL檢測試劑盒由美國Roche公司生產； OLYMPUSB X50光學顯微鏡由日本OLYMPUS公司生產； Mias-2000圖像分析系統由四川大學智勝軟件股份有限公司生產。

1．3 動物分組及造模

80只GK大鼠適應性飼養 1周后, 隨機血糖值11.1m mo l · L-1以上者60只入選本實驗。 按隨機數字表法分為GK組、模型組、中藥組各20只，正常Wistar大鼠20只,另設正常組作為空白對照共4組。

造模同時開始給藥,周期5周,正常組、GK組喂飼普通飼料，模型組和中藥組喂飼高脂飼料。正常組、GK組、模型組均按5 ml/(kg· d)灌服生理鹽水，中藥組按 1.44 g/(kg· d) (相當于成人劑量的 10倍,成人按60 kg計)灌服中藥混懸液。具體方法: 稱取參芪復方浸膏7.2 g,加無菌水25 ml使勻,按5 ml/(kg· d)灌胃。大鼠造模給藥35 d后處死,下腔靜脈采集血樣,并剝離胸、腹主動脈備檢。

1．4 實驗指標及檢測方法

1.4.1 實驗指標 觀察動物的毛色、攝食、體質量、飲水、小便、大便、拉尾排便、神態、活動情況等癥狀，檢測FBG、TC、TG、血清INS、血管內皮細胞凋亡和Caspase-3表達等。

1.4.2 平均熒光強度檢測 采用原位末端標記Tunel法檢測, 參照Roche原位細胞凋亡檢測 POD試劑盒及濃縮型 DAB試劑盒操作, 激發光波長450～500 nm, 檢測波長515～ 565 nm, 在熒光活體微循環顯微鏡系統下觀察熒光染色結果, 每個組織>400× 視野下隨機選5個視野, 平均熒光強度=累積熒光強度/發光物體的表面積。

1.4.3 Caspase-3表達 采用免疫組組織化學染色，用OLYMPUSB X50光學顯微鏡觀察染色結果, 每張切片隨機選5個視野, 輸入Mias-2000圖像分析系統,在200倍鏡下分別測量內皮細胞 Caspase-3陽性物質積分光密度及平均光密度并計算其均值。

1．5 統計學方法

2 結果

造模過程中，因灌胃不當造成糖尿病對照組大鼠死亡1只，其余無異常。

2．1 大鼠癥狀比較

造模后，GK組、模型組大鼠均出現神疲、懶動或躁動、毛色黃而少澤、飲水攝食增多、尿量增多、生長增加減緩、拉尾排便、尾色變暗等糖尿病大鼠氣陰兩虛的共同特征，其中模型組的表現尤為明顯。上述癥狀及體征在使用中藥治療反證后與模型組比較均有明顯改善。

2．2 各組大鼠平均每日攝食和平均體質量比較(表2)

2．3 各組大鼠FBG、 TC、 TG、FINS、HOMA-IR結果比較(表3)

表1 各組大鼠癥狀情況

表2 各組大鼠平均攝食和平均體質量結果比較±s)

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01；與中藥組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

表3 各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、 TC、 TG結果比較

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01；與中藥組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01(HOMA- IR=(FBG × FINS)/22．5)

2．4 各組大鼠胸主動脈內膜凋亡內皮細胞平均熒光強度和腹主動脈內皮細胞caspase-3表達水平結果比較(表4、圖1、2)

表4 各組大鼠胸主動脈內膜凋亡內皮細胞平均熒光強度和腹主動脈內皮細胞caspase-3表達水平結果比較±s)

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01；與中藥組比較:▲▲P<0.01

圖1 胸主動脈平均熒光強度結果注：從左到右依次為正常組、GK組、模型組、中藥組

圖2 腹主動脈caspase-3免疫組化染色(×200)注：從左到右依次為正常組、GK組、模型組、中藥組

2．5 大鼠腹主動脈病理結果比較

圖3顯示，正常組大鼠腹主動脈內膜平坦,內皮細胞扁平,緊貼于平直的內彈力板上,中彈力板與平肌細胞整齊相間平行排列,內膜光滑整齊；GK組內皮細胞腫脹,未見明顯脂質沉積；模型組腹主動脈病理顯示，有大小不一的內膜增厚病灶，內皮細胞腫脹、數目增多，內皮下細胞浸潤，內膜斷裂不平整，脂質沉積比較明顯，可見多個泡沫細胞；中藥組腹主動脈內膜大部分無增厚，偶見內膜增厚病灶及泡沫細胞，數目較西藥組少，內膜增厚處內皮細胞腫脹，內皮下細胞浸潤及脂質沉積不明顯。

圖3 腹主動脈病理HE染色(×400倍)注：從左到右依次為正常組、GK組、模型組、中藥組

3 討論

糖尿病大血管病變屬于中醫學 “消渴”“痹癥”等范疇，氣陰兩虛是本病的基本病機，故本實驗以建立2型糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態模型為主要研究對象。

目前2型糖尿病的造模方法主要有自發形成、誘導形成及基因敲除等方法[2]。本研究在參考相關文獻[3-10]后，采用自發形成糖尿病和誘導形成大血管病變相結合的造模途徑。一方面，自發性糖尿病動物模型GK大鼠是通過重復數代近親繁殖葡萄糖耐量處于上限的Wister大鼠而發展起來的。GK大鼠在發病后，明顯出現類似于糖尿病病人“三多一少”的臨床癥狀[11]。 研究指出，GK大鼠胰島組織的形態學變化與2 型糖尿病發病機制相近，GK大鼠死亡率低，血糖維持水平與臨床病人接近，動物的感染癥狀不明顯。 研究結果說明，GK大鼠的優點更適合2 型糖尿病發病機制及其并發癥的研究。另一方面，糖尿病及大血管病變的發生與飲食密切有關。《素問·奇病論》記載：“此肥美之所發也，此人必數食甘美而多肥也，肥者令人內熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉為消渴。”《素問·痹論》曰：“飲食自倍， 腸胃乃傷。”本研究在中醫學理論指導下，采用高脂飼料喂養誘導模型大鼠的發生。GK大鼠為自發性糖尿病大鼠，既有先天不足的稟賦因素存在，又有本“虛”的特性，且處于“虛”態。GK大鼠通過高脂飲食誘導，類似于中醫理論中肥甘厚味損傷脾胃，脾胃虛弱則氣血生化乏源，在糖尿病“虛”態的基礎上增加了氣血不足的因素，先天不足加上后天乏源，故與中醫氣陰兩虛病機有相似之處[12-14]。

研究結果說明，模型組大鼠明顯出現血糖升高、血脂代謝紊亂、胰島素抵抗、大血管內皮細胞凋亡增加和大血管組織病理改變等情況，其發病過程及特征與糖尿病大血管病變的臨床表現基本相似，屬于2型糖尿病大血管病變早中期的典型特點。本研究和前期研究都發現，高脂飼料喂養的GK大鼠，其證候表現為精神萎靡、懶動或躁動、毛色枯黃、飲水攝食增多、尿量增多、生長增加減緩、拉尾排便、尾色變暗等，與人體“氣陰兩虛”證的臨床表現具有相似性。模型大鼠的FBG、TC、TG、FINS、HOMA-IR升高，一是由于氣虛不能轉化體內精微物質所致，二是陰液不足不能稀釋血液所致；胸主動脈平均熒光強度和腹主動脈caspase-3表達水平的升高，以及腹主動脈病理顯示內膜增厚、細胞腫脹、細胞浸潤、內膜斷裂等表現，均是由于行于脈內的“營”陰不足不能濡養血管，氣虛不能正常推動血液運行所致。在使用益氣養陰的參芪復方后，中藥組可觀察到大鼠證候表現及血糖升高、血脂代謝紊亂、胰島素抵抗、大血管內皮細胞凋亡增加和大血管組織病理改變等情況均有明顯的改善。這也從反面佐證了本研究中糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態模型的成功建立。

綜上所述，本研究在自發性糖尿病GK大鼠基礎上，再結合高脂飲食誘導的方式，初步建立了既符合現代醫學 2 型糖尿病大血管病變特征、又含有中醫學“氣陰兩虛”特點的病證結合大鼠模型。此模型與臨床2 型糖尿病大血管病變氣陰兩虛型的臨床表現、發病機制相似，且時間較短、死亡率低、成功率高，是研究2型糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態的成功模型。

[1] 中華醫學會糖尿病分會糖尿病慢性并發癥調查組.全國住院糖尿病患者慢性并發癥及其相關危險因素10年回顧性調查分析[J].中國糖尿病雜志,2003,11(4):232-238.

[2] 趙保勝，董淑云，霍海如，等．2 型糖尿病動物模型的研究進展[J]．中國實驗方劑學雜志，2005，11(5):62．

[3] 胡泊洋,江道峰,王張,等．自發性 2 型糖尿病動物模型 GK 大鼠的發病特征研究[J]．中國實驗方劑學雜志，2013，19(10):203-206．

[4] 龐宗然,李曉軍,劉祖涵,等．2 型糖尿病合并大血管病變動物模型的建立和評價[J]．中國中醫基礎醫學雜志，2009，15(9):656-662．

[5] 彭聰，鄭承紅．2 型糖尿病合并大血管病變模型的建立[J]．湖北中醫雜志，2012，34(1):66-68．

[6] 鄭方遒，李敬林，劉偉．2型糖尿病氣陰兩虛證病證結合模型的研究[J]．中華中醫藥雜志，2009，24(5):593-595．

[7] 吳憶, 李敬林, 張銳，等．2 型糖尿病氣陰兩虛證動物模型研究及反證中藥對證候的影響[J]．遼寧中醫雜志，2005，32(7):735-736．

[8] 張雯，莊秀園，逄秀鳳，等．幾種實驗性 2 型糖尿病動物模型制備方法的比[J]．現代生物醫學進展，2011，11(23):4576-4578．

[9] 靳瑾,孫侃,薛以貴，等．實驗性糖尿病大血管病變 S D 大鼠模型的建立[J]．石河子大學學報： 自然科學版，2009，27(5):622-624．

[10] 吳晏， 韓靜， 郭淑貞，等．2型糖尿病病證結合動物模型的研究[J]．中華中醫藥雜志，2011，26(7):1558-1560．

[11] 孫煥，陳廣，陸付耳．介紹幾種誘發性糖尿病動物模型[J]．中國實驗方劑學雜志，2007，13(2):65．

[12] 陳敏,莊燦,謝春光,等.參芪復方對GK大鼠大血管病變內皮細胞凋亡影響的實驗研究[J].時珍國醫國藥,2010,21(9): 2165-2166.

[13] 王芬,何華亮,張紅敏,等.參芪復方對GK大鼠脂代謝異常的實驗研究[J].天津中醫藥，2007,24(6):507-508.

[14] 劉椏,謝春光,莊燦,等.參芪復方對GK大鼠2型糖尿病大血管病變內皮保護作用的實驗研究[J].遼寧中醫雜志，2010,37(6):1163-1165.

歡迎訂閱《中醫雜志》

《中醫雜志》(ISSN 1001-1668，CN 11-2166/R)是由中華中醫藥學會和中國中醫科學院主辦的全國性中醫藥綜合性學術期刊。1955年創刊以來始終堅持"以提高為主，兼顧普及"的辦刊方針，是我國中醫藥界創刊早、發行量大、具有較高權威性和學術影響力的國家級中醫藥期刊之一，是中國中文核心期刊和科技核心期刊、中國精品科技期刊、首屆國家期刊獎獲得者和中國期刊方陣雙獎期刊、新中國60年有影響力的期刊、中國百強科技期刊、中國百種杰出學術期刊，榮獲第二屆、第三屆新聞出版政府獎期刊獎提名獎。

《中醫雜志》主要欄目中當代名醫和臨證心得分別介紹名老中醫和臨床醫生辨證用藥治療疑難病的經驗;臨床研究介紹中醫藥治療的新方法、新成果；學術探討、思路與方法、專家論壇、病例討論、綜述、百家園等欄目，提供最新學術觀點、研究成果與治療方法,成為學習中醫藥、研究中醫藥，不斷提高臨床及研究水平的良師益友。

《中醫雜志》為半月刊，每月2日和17日出版,每期定價15.00元，全年360元。讀者可以到全國各地郵局辦理訂閱手續(郵發代號:2-698),也可以與本刊讀者服務部聯系郵購，郵購免郵費。電話：010-64035632，010-64089195。國外發行：中國國際圖書貿易總公司(北京399信箱，郵編：100044，代號：M140)。

本社地址：北京市東城區東直門內南小街16號，郵政編碼：100700。網址：http://zzyz.chinajournal.net.cn。

Establishment of the “Qi and Yin Deficiency” Model in the Diabetic Macrovascular Diseases

LI Hai-yang1， QIN Hai-zhi1， CHAO Jun1， FANG Chuan-ming1， FU Xiao-xu1， GAO Hong2， XIE Chun-guang2△

(1．ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，ChengduSichuan610075,China; 2．AffiliatedHospital,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，ChengduSichuan610075,China)

Objective: To establish models of Qi and Yin deficiency state and syndrome in diabetes mellitus macroangiopathy.Methods: 20 Wistar rats were included in the control group, while 60 male GK rats (random blood glucose >11.1 mmol/L)were randomly divided into GK group,model group and Chinese traditional medicine(TCM) group,20 rats in each group. Control group and GK group feed ordinary,model group and TCM group eat with high fat feed.TCM group had a Chinese medicine treatment at the same time. After 5 weeks, testing fasting blood ghcose、 fasting serum insulin (FINS), insulin resistance index (HOMA IR),Total cholesterol; triglycerides and vascular endothelial cell apoptosis;caspase-3 express;Light microscope observe pathology of the Abdominal aorta.Results: compared with the control group and GK group, the blood glucose, TC,TG, insulin resistance, vascular endothelial cell apoptosis, and large blood vessels tissue pathological have significant differences.Compared with the control group, TCM group all the indexes have improved significantly.Conclusion: By feeding the GK rats with high-fat feed,models of Qi and Yin deficiency state and syndrome in type 2 diabetes mellitus macroangiopathy was successfully established．

Diabetes mellitus macroangiopathy; Qi and Yin deficiency, Animal models

國家自然科學基金資助項目(81273749)-養陰益氣活血法阻斷糖尿病大血管病變GK大鼠代謝記憶的量效關系研究及表觀遺傳學機制；國家自然科學基金青年基金項目(81102589)-養陰益氣活血法雙向調控PI3-K信號系統對防治糖尿病大血管病變的拆方研究

李海洋(1985-)，男，江西信豐人，在讀博士，從事中醫藥防治內分泌代謝病的臨床與實驗研究。

△通訊作者：謝春光(1964-)，男，教授，博士研究生導師，從事中醫藥防治內分泌代謝病的臨床與實驗研究，E-mail：xcg718@aliyun.com。

R587.1

B

1006-3250(2017)03-0325-04

2016-09-04