基于UPLC/Q-TOF-MS研究代謝綜合征痰瘀互結證的物質基礎*

楊宇峰，徐 娜，滕 飛

(遼寧中醫藥大學，沈陽 110847)

基于UPLC/Q-TOF-MS研究代謝綜合征痰瘀互結證的物質基礎*

楊宇峰，徐 娜，滕 飛

(遼寧中醫藥大學，沈陽 110847)

目的:采用基于超高效液相色譜與串聯四級桿飛行時間質譜儀(UPLC/Q-TOF-MS)聯用的代謝組學技術，研究代謝綜合征痰瘀互結證動物模型血清中小分子代謝物的變化。方法：模型組大鼠復制成痰瘀互結證代謝綜合征，運用UPLC/Q-TOF-MS技術檢測空白對照組和模型組血清樣本中的小分子代謝產物，對所得到的代謝指紋圖譜進行判別分析，找出具有差異的特征代謝物并追溯其來源。結果：鑒定出的潛在生物標志物主要有溶血磷脂酰膽堿、苯丙氨酸、酪氨酸、十四烷酸、硬脂酸、D-葡糖酸、前列腺素B1等內源性代謝物。結論：痰瘀互結證代謝綜合征的發生與糖類、脂類、氨基酸代謝紊亂有關，這些體內的小分子化合物可能是痰瘀互結證代謝綜合征中醫證候的物質基礎。

痰瘀互結證；代謝綜合征；代謝組學

代謝組學(metabolic syndrome，MS)通過對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式，是系統生物學的組成部分[1-2]。它以組群指標分析為基礎，以高通量檢測和數據處理為手段，再結合模式識別方法，可以判斷出生物體的病理生理狀態，并有可能找出與之相關的生物標志物[3]。代謝組學所具有的組、群、譜集成分析功能的特點，對于闡明中醫證候的本質規律有明顯優勢。

基于代謝組學在闡明中醫證本質方面蘊涵著巨大潛力，本研究采用基于超高效液相色譜與串聯四級桿飛行時間質譜儀(Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC/Q-TOF-MS)技術的代謝組學方法，對痰瘀互結證代謝綜合征大鼠血清中內源性代謝物進行了分析鑒定，尋找痰瘀互結證代謝綜合征病變的特征性代謝產物，確定相關代謝譜，以期闡明痰瘀互結證代謝綜合征中醫證候生物學的物質基礎。

1 材料

1.1 動物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，體質量(180±20)g，由遼寧中醫藥大學教學實驗中心提供(動物合格證號SCXK(遼)2004-0018)。大鼠按隨機數字表法分為空白組和模型組各20只。

1.2 材料與試劑

乙腈(HPLC)、甲醇(HPLC)購自MERK 公司(USA)，甲酸購自TEDIA 公司(USA)，膽固醇購自國藥集團化學試劑有限公司(批號F20061011)，鏈脲佐菌素購自北京邦定泰克生物技術公司(批號STZ-S0130)，其他試劑均為市售分析純。

1.3 主要儀器設備

超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用儀(美國Waters 公司)、超低溫冰箱(MDF-U53V，三洋)、TG16-WS 臺式高速離心機(湘儀離心機儀器有限公司)。

2 方法

2.1 造模方法

模型組給予鏈脲佐菌素(30 mg/kg)腹腔注射，高脂高糖飼料持續喂養直至12周，復制成痰瘀互結證代謝綜合征模型。空白對照組以等量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射后普通飼料喂養直至12周。

2.2 樣本采集

各組大鼠用異戊巴比妥鈉(異戊巴比妥鈉麻醉)麻醉，于腹主動脈取血，使用肝素鈉抗凝分離血清。

2.3 樣本制備

吸取100 μL樣本置于離心管中，按1∶1比例加入400 μL色譜級甲醇和乙腈劇烈震蕩混合均勻，4℃靜置10 min，然后以15000 rpm離心15 min，吸取上層清液并經0.2 μm濾膜過濾，作為待測樣品。

2.4 UPLC/Q-TOF-MS 分析

利用MarkerLynx 軟件對采集的原始質譜數據進行離子對的提取、峰對齊、峰匹配和基線矯正等操作，并導入到Simca-P11.5軟件中分別進行主成分分析和偏最小二乘方判別分析。

3 結果

3.1 原始色譜圖檢測

圖1顯示，對所有質控樣本(quality control，QC)進行LC-MS分析，得到QC總離子流色譜圖。

3.2 主成分分析(PCA)

圖2顯示，統計分析發現2組樣本在PCA上不能分離。

圖1 正離子模式下QC的UPLC/Q-TOF-MS總離子流

圖2 ESI+模式下痰瘀互結證代謝綜合征大鼠血樣代謝PCA分析Scores圖注：PC=2，R2X=0.227，R 2Y=0.134，Q2=-0.144 Group C=空白組， Group D=模型組

3.3 偏最小二乘方-判別分析(PLS-DA)

圖3、4顯示，在PLS-DA處理下，模型組與空白組得到很好的分離。結果顯示，模型在ESI+模式下(R2X=0.578，R2Y=0.986，Q2=0.892)，即其中57.8%的變量被作為塑造模型的主要成分，98.6%的樣本符合模型判別，模型預測能力為89.2%。

圖3 ESI+模式下痰瘀互結證代謝綜合征大鼠血樣代謝PLS-DA分析Scores二維圖注：PC=2，R 2X=0.578，R 2Y=0.986，Q2=0.892 Group C=空白組， Group D=模型組

圖4 ESI+模式下痰瘀互結證代謝綜合征大鼠血樣代謝PLS-DA分析loading圖

3.4 尋找差異性代謝物

表1顯示，本實驗將第一主成分的VIP>1且有統計學意義的變量(P<0.05) 作為標記物的判斷標準，根據它們精確分子量與Human Metabolome Database(HMDB) 和Metlin等質譜數據庫進行信息匹配,鑒定出7種生物標志物，與對照組比較差異顯著。

表1 潛在生物標志物鑒定結果

4 討論

通過實驗研究，分析鑒定出了7種與痰瘀互結證代謝綜合征大鼠模型相關的潛在生物標記物，將這些潛在生物標志物通過生物化學和生物信息學等數據庫檢索相關代謝途徑，發現痰瘀互結證代謝綜合征大鼠模型體內存在葡萄糖代謝、脂肪酸代謝、氧化應激、三羧酸循環、肝糖異生、脂肪酸氧化等代謝途徑的異常，而這些潛在的生物標志物正是體內糖類、脂類、氨基酸等代謝紊亂的結果。

溶血磷脂酰膽堿(LPE)是氧化低密度脂蛋白中的主要磷脂。越來越多的證據表明，由LPE介導的信號傳導是動脈粥樣硬化的重要因素，LPE是動脈粥樣硬化發展風險的潛在生物標志物[4]。國外臨床研究也揭示了LPE是特異性中風和大動脈動脈粥樣硬化新的候選生物標志物，有較高的預測能力[5]。異亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸與空腹血糖水平和胰島素抵抗密切相關[6]。最新研究表明，芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)與中國人群胰島素抵抗和糖尿病發生顯著相關，這些標志物對未來糖尿病發展具有較高的預測價值[7]。酪氨酸水平還與不良心血管事件有關，研究表明酪氨酸可作為心血管風險的生物標志物[8]。十四烷酸又稱為肉豆蔻酸，是一種飽和脂肪酸，與肥胖患者血清葡萄糖和胰島素敏感性相關[9]，是心血管事件的風險因素[10]。大型前瞻性隊列研究發現，十四烷酸與糖尿病風險相關，肝臟新生脂肪通過飽和脂肪酸(肉豆蔻酸)的合成影響胰島素體內平衡[11]。棕櫚油酸是有益的脂肪酸，其脂肪組織分泌的n-7單不飽和脂肪酸與外周組織中降低的胰島素抵抗相關[12]，它不僅可通過抑制炎癥增加胰島素敏感性，而且通過抑制胰島素分泌性胰腺β細胞的破壞[13]，改善胰島素抵抗和糖尿病。前列腺素E2(PGE2)是來源于花生四烯酸的脂質信號，是機體內一系列生理功能的重要調節劑，包括全身性炎癥和胰島素的胰島素分泌，可抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌[14]。

[1] BAIN JR，STEVENS RD，et al．Metabolomics applied to diabetes research: moving from information to knowledge[J]．Diabetes，2009，58(11):2429-443．

[2] SALEK RM，MAGUIRE ML，et al．A metabolomic comparison of urinary changes in type 2 diabetes in mouse，rat，and human[J]．Physiol Genomics，2007，29(2):99-108．

[3] 劉雙梅，李桂林，湯曉麗，等.甲基蓮心堿對2型糖尿病模型大鼠作用的代謝組學研究[J]. 中國藥理學通報，2012，28(4):490．

[4] AKERELE OA, CHEEMA SK. Fatty acyl composition of lysophosphatidylcholine is important in atherosclerosis[J]．Medical Hypotheses，2015，85(6):754-60.

[5] JOVé M, MAURI-CAPDEVILA G, et al．Metabolomics predicts stroke recurrence after transient ischemic attack[J]．Neurology，2015，84(1):36-45.

[6] OTTOSSON F, ERICSON U, et al．Postprandial Levels of Branch Chained and Aromatic Amino Acids Associate with Fasting Glycaemia[J]．Journal of Amino Acids，2016(4):1-9.

[7] CHEN T, NI Y, et al．Branched-chain and aromatic amino acid profiles and diabetes risk in Chinese populations[J]．Scientific Reports，2016, 6:20594.

[8] GRUSON D, HERMANS MP，et al．Sflt-1 in heart failure: relation with disease severity and biomarkers[J]．Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation，2016，76(5):411-416.

[9] BADOUD F, LAM KP, et al．Metabolomics Reveals Metabolically Healthy and Unhealthy Obese Individuals Differ in their Response to a Caloric Challenge[J]．Plos One，2015，10(8):e0134613.

[10] EBBESSON SO, VORUGANTI VS, et al．Fatty acids linked to cardiovascular mortality are associated with risk factors[J]．International Journal of Circumpolar Health，2015，74:28055.

[11] MA W, WU JH, et al．Prospective association of fatty acids in the de novo lipogenesis pathway with risk of type 2 diabetes: the Cardiovascular Health Study[J]．American Journal of Clinical Nutrition，2015，101(1):153-163.

[12] PASSOS ME, ALVES HH, et al．Differential effects of palmitoleic acid on human lymphocyte proliferation and function[J]．Lipids in Health & Disease，2016, 15(1):217.

[13] FEYZABADI Z, PASALAR M. Analysis of Almond-Violet Oil by Gas Chromatography (A Traditional Formula)[J]．Iranian Journal of Medical Sciences，2016，41(3 Suppl):S2.

[14] CARBONEAU BA, BREYER RM, et al．Regulation of pancreatic β-cell function and mass dynamics by prostaglandin signaling[J]．Journal of Cell Communication and Signaling，2017，doi: 10.1007/s12079-017-0377-7.

Study on the Material Basis of Phlegm and Blood Stasis Syndrome in the Metabolic Syndrome Based on UPLC/Q-TOF-MS

YANG Yu-feng，XU Na，TENG Fei

(LiaoningUniverstityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China)

Objective: We analyzed the changes of endogenous metabolites in serum of rats with the syndrome of phlegm and blood stasis syndrome based on UPLC/Q-TOF-MS．Methods: We used UPLC/Q-TOF-MS technology and detected small molecule metabolites in plasma and identified the differences in characteristics of metabolites and found some biomarkers，so as to identify biomarkers and its origins and metabolic pathway. Results: The identified potential biomarkers include LysoPE、Phenylalanine、Tyrosine、14-alkyl acid、Stearic acid、D- glucose、Prostaglandin B1．Conclusion: The occurrence of metabolic syndrome of phlegm and blood stasis syndrome is related to the disorder of carbohydrate, lipid and amino acid metabolism.

Phlegm and blood stasis syndrome; Metabolic syndrome; Metabolomics

遼寧省百千萬人才工程培養項目(遼人社〔2014〕229號)

楊宇峰(1979-)，男(回族)，遼寧凌源人，副教授，醫學博士，從事糖尿病及代謝綜合征中西醫結合臨床與研究。

R589

B

1006-3250(2017)03-0329-03

2016-08-17