從醛固酮(ALD)的分泌與合成探討硝菔通結方從腎論治便秘的作用機制*

梁星琛，周永學，閆曙光，張小波

(1.成都中醫藥大學，成都 610075；2.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046)

從醛固酮(ALD)的分泌與合成探討硝菔通結方從腎論治便秘的作用機制*

梁星琛1，周永學2△，閆曙光2，張小波2

(1.成都中醫藥大學，成都 610075；2.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046)

目的：觀察硝菔通結方對功能性便秘大鼠醛固酮(ALD)合成和分泌的影響，從現代醫學腎臟調節水液代謝的角度揭示硝菔通結方從腎論治便秘的作用機制。方法：48只成年雄性SD大鼠采用隨機數字表法分為空白組(8只)和造模組(40只)，造模組灌胃復方地芬諾酯混懸液6周復制便秘模型后隨機分為模型組(FC組)、硝菔通結方高、中、低劑量組、陽性藥物對照組(蓯蓉通便口服液組，簡稱口服液組)。各治療組給予不同劑量的硝菔通結方，陽性藥物對照組給予蓯蓉通便口服液(后簡稱口服液組)灌胃1個月。觀察各組大鼠的一般情況以及結腸含水率，ELISA法檢測各組大鼠血清中醛固酮(ALD)、腎素(PRA)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、血管緊張素轉化酶(ACE)的含量,RT-PCR法檢測腎臟組織中MRmRNA的水平，Western-Blot法檢測結腸組織中AQP3的表達。結果：模型組大鼠糞便量少、質地干硬，結腸含水率明顯降低，血清中ALD、PRA、AngⅡ、ACE的含量升高，腎臟組織中MRmRNA表達升高，結腸組織中AQP3的表達明顯升高；與模型組比較，各劑量硝菔通結方治療組以及口服液組大鼠糞便量增加且質地稀軟，結腸含水率增高，血清中ALD、PRA、AngⅡ、ACE的含量均降低，腎臟組織中MRmRNA表達降低，結腸組織中AQP3的表達顯著降低。結論：腎臟能通過調節ALD合成與分泌而影響腸道的水液代謝，這可能是中醫從腎論治便秘的科學內涵之一，硝菔通結方可通過影響ALD合成與分泌調節腸道的水液代謝，從而對功能性便秘發揮治療作用。

硝菔通結方；功能性便秘；ALD；RAAS

便秘是以排便次數減少、糞便量減少、糞便干結、排便費力等表現為主的一種復雜癥狀?，F代研究表明，腸道水液代謝紊亂引起的腸道功能失常是功能性便秘形成的核心因素，調節腸道水液代謝成為功能性便秘治療的關鍵[1-2]。硝菔通結方是周永學教授根據“腎主水司二便”理論創制的對功能性便秘臨床療效確切的方劑。前期研究發現，該方能有效調節腸道水液代謝，改善功能性便秘大鼠所出現的脫毛、毛色干枯、膀胱水液潴留、扎堆等與中醫“腎虛”相關的癥狀，但其治療腎虛的機制尚不清楚。中醫學的“腎”主要是功能概念，其“主水司二便”的功能與現代醫學腎臟調節水液的作用相類似。腎臟主要是通過調節水電解質的重吸收和分泌在水液代謝方面發揮重要作用，其對水液代謝的調節作用主要是通過調節醛固酮(ALD)的合成與分泌、涉及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)來實現的[3]。因此本次研究擬以與腎臟水液代謝密切相關的ALD以及RAAS系統為切入點，觀察功能性便秘發生時腸道水液代謝與該系統的變化，進一步觀察硝菔通結方對其影響，以期從現代醫學腎臟調節水液角度探討中醫“腎主水司二便”的科學內涵，揭示硝菔通結方從腎論治便秘的作用機制，現將研究結果報告如下。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠48只，體質量(200±20)g，購于中國人民解放軍第四軍醫大學實驗動物中心(許可證號SCXK-(軍)2012-0007)。

1.2 藥物及制備

硝菔通結方(芒硝30 g，鮮萊菔1000 g，肉蓯蓉15 g，當歸15 g，白術15 g)中鮮萊菔購于市場，其余中藥飲片購于陜西興盛德中藥飲片有限公司，并經陜西中醫藥大學中藥教研室鑒定合格。鮮萊菔切片水煮至熟爛撈出得濃汁，納芒硝至完全融化，其他藥物納入同煎，濃縮至56 ml(19 g/ml)，滅菌后于4℃冰箱保存。復方地芬諾酯片(常州康普藥業有限公司，批號1509020)粉碎后用蒸餾水配置成地芬諾酯混懸液，4℃冰箱保存。蓯蓉通便口服液購于天水岐黃藥業有限責任公司(批號20160323)。

1.3 儀器與試劑

ELX808型酶標儀(美國Bio-Tek公司)；KDC-40型低速離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司)；高速冷凍離心機(日本日立CR22G II)；KDC-40低速離心機(科大創新股份有限公司)；全自動凝膠成像系統(美國ProteinSimple公司FC3)；大鼠血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)ELISA KIT、醛固酮(ALD)ELISA KIT、大鼠血管緊張素轉化酶(ACE)ELISA KIT、大鼠腎素(PRA)ELISA KIT，以上試劑均來自伊萊瑞特生物科技有限公司；CDNA合成試劑盒、Q-PCR試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)；MR引物設計與合成(ABI公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海貝博生物公司)；RIPA組織細胞裂解液(北京碧云天生物技術研究所)；PMSF(江蘇碧云天生物技術研究所)；TEMED(Sigma公司)；吐溫20 (Tween20)(Sigma公司)；PVDF膜(Immobilon-P)；4×上樣緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)；10×電轉液(北京索萊寶科技有限公司)；ECL化學發光液(Biological Industries)。

2 方法

2.1 動物分組

清潔級雄性SD大鼠48只，按隨機數字表法分為空白組(8只)和造模組(40只)，造模組灌胃復方地芬諾酯混懸液6周復制便秘模型，待大鼠出現明顯的糞便量減少、糞便顆粒變小、糞質變干等便秘癥狀后再次采用隨機數字表法分為功能性便秘模型組(FC組)、硝菔通結方高劑量組、中劑量組、低劑量組、蓯蓉通便口服液組(簡稱口服液組)各8只。

2.2 動物模型建立

根據本課題前期實驗中大鼠功能性便秘模型的建立方法，各組大鼠適應性喂養1周后，FC組、硝菔通結方各劑量組及口服液組給予10 ml/kg體積(1.5 mg/ml濃度)復方地芬諾酯混懸液灌胃，空白組以等體積生理鹽水灌胃，每天1次，共給藥6周。當大鼠出現精神狀態差、進食減少、喜扎堆、糞便量少、質地干硬等表現時，為造模成功。

2.3 給藥方法及劑量

造模結束后，空白組和便秘模型組正常飼養，并以0.9%生理鹽水灌胃。根據大鼠與人之間的用藥劑量換算方法，大鼠高、中、低劑量組給藥量分別為高劑量380 g/kg，中劑量190 g/kg，低劑量95 g/kg。根據蓯蓉通便口服液的臨床等效劑量，口服液組給予蓯蓉通便口服液每只0.3 mL/次灌胃。

2.4 實驗技術與檢測方法

2.4.1 一般情況觀察 每日觀察動物一般行為表現及排便情況。

2.4.2 ELISA法檢測模型大鼠血中ALD、PRA、AngⅡ以及ACE的含量 末次給藥2 h后，10%水合氯醛300 mg·kg-1ip麻醉，用真空采血負壓管腹主動脈取血采血3～5 ml，室溫放置30 min后，將KDC-40低速離心機調至3000 r·min-1離心10 min，10 min后分離待測血清，大鼠ALD、PRA、AngⅡ和ACE按ELISA試劑盒說明書步驟進行。

2.4.3 RT-PCR法檢測腎臟MRmRNA的表達 按Trizol試劑盒提取腎臟總RNA測其濃度值并定量，然后進行逆轉錄。PCR引物由ABI公司的Primer Express Software v 2.0設計，MR引物上游：5′-TGCCATCCAGGATGTGGTTC-3′，下游：5′- GGCCAGTCACACCATTGGAG -3′，同時擴增β-actin為內參，其引物上游：5′- TCACCCACACTGTGCCCATC -3′，下游：5′- AGCTGTAGCCACGCTCGGTC -3′，實驗嚴格按照說明書進行，PCR反應條件為95℃ 2 min，94℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 40 s，共40個循環。反應結束后上凝膠，電泳凝膠分析軟件分析結果。各組MRmRNA的表達水平以相對表達量即MRmRNA與β-actin的比值來表示。

2.4.4 結腸含水率的測定 給藥結束后，24 h內大鼠禁食不禁水，腹腔注射麻醉(10%的水合氯醛4 ml/kg),取肛門上方2 cm部位結腸組織，冰生理鹽水清洗稱取濕重，放置60℃恒溫干燥箱干燥稱其干重，計算結腸含水率。結腸含水率=(濕重-干重)/濕重×100%。

2.4.5 Western-Blot法檢測大鼠結腸組織中AQP3的表達 RIPA裂解液提取結腸組織總蛋白充分震蕩，冰上放置30 min，4℃12000 r/min離心3～5 min，收集上清液。采用BCA法進行總蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳，每孔加入50 μg蛋白，用夾心法電轉至PVDF膜上，封閉液(1×TBST，3%脫脂奶粉)室溫封閉1 h。將一抗用封閉液(5%脫脂奶粉+TBST)稀釋500倍，將洗好的膜放入塑料袋中加入稀釋好的一抗4 ml進行孵育，4℃過夜。用洗滌液(1×TBST)洗滌3次，每次10 min。將二抗用封閉液(5%脫脂奶粉+TBST)稀釋1000倍，將洗好的膜放入塑料袋中加入稀釋好的二抗4 ml進行孵育，室溫2 h。用洗滌液洗滌3 次，每次10 min，將膜平放于干燥的ECL發光板，將新鮮配置好的ECL發光液(A液2 ml+B液2ml)滴加到標記過的膜表面，采用全自動凝膠成像系統進行拍照。Western blot結果用光密度掃描分析軟件分析各條帶的光密度值，以積分光密度值(IOD)表示。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 一般情況表現

造模開始后大鼠出現精神狀態差、倦怠倦臥、喜扎堆、食量減少、糞便量少、質地干硬等表現，部分大鼠出現小便不利或(和)被毛脫落且光澤度下降等表現。給藥治療后，硝菔通結方低、中、高劑量組大鼠上述癥狀逐漸減輕至消失，其中高劑量組最為明顯。

3.2 對功能性便秘大鼠血清ALD含量的影響

表1顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清中的ALD含量升高(P<0.05)，表明便秘發生時腎臟的水液代謝亦受到影響；與模型組比較，硝菔通結方各劑量組與口服液大鼠血清中ALD含量明顯降低(P<0.05)，表明硝菔通結方及蓯蓉通便口服液能調節腎臟的水液代謝。

表1 硝菔通結方對功能性便秘大鼠血清ALD的影響±s)

注：與空白組比較:★P<0.05；與模型組比較:▲P<0.05

3.3 對功能性便秘大鼠RAAS系統的影響

表2顯示， 與空白組比較，模型組大鼠血清中PRA含量顯著高于空白組(P<0.01),血清中AngⅡ以及ACE含量均高于空白組(P<0.05)；與模型組比較，硝菔通結方各劑量組與口服液組大鼠血清中AngⅡ及ACE含量降低(P<0.05)，大鼠血清中PRA的含量顯著降低(P<0.01)。

表2 硝菔通結方對功能性便秘大鼠血清PRA、AngⅡ以及ACE的影響±s)

注：與空白組比較:★P<0.05，★★P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.4 對功能性便秘大鼠腎臟MRmRNA表達的影響

表3顯示，與空白組比較，模型組大鼠腎臟MRmRNA表達升高(P<0.05)；與模型組比較，硝菔通結方各劑量組與陽性藥物對照組大鼠腎臟MRmRNA明顯降低(P<0.05)。

3.5 結腸含水率

表4顯示，與空白組比較，模型組大鼠結腸含水率明顯減少(P<0.01)，與模型組比較，硝菔通結方高劑量組及陽性藥物對照組大鼠結腸含水率顯著增多(P<0.01)，中劑量組和低劑量組大鼠結腸含水量增多(P<0.05)。

3.6 硝菔通結方對功能性便秘大鼠結腸組織中水通道蛋白3表達的影響

3.7 硝菔通結方對功能性便秘大鼠結腸組織中AQP3表達的影響

圖1表5顯示，與空白組比較，模型組大鼠結腸組織AQP3表達明顯升高(P<0.01)，表明便秘發生時，由AQP3所介導的腸道水液代謝出現了紊亂；給藥治療后，與模型組比較硝菔通結方各劑量組以及陽性藥物對照組大鼠結腸AQP3表達水平降低(P<0.05)，其中高劑量組大鼠結腸AQP3表達水平顯著降低(P<0.01)。

表3 硝菔通結方對功能性便秘大鼠腎臟MRmRNA表達的影響

注：與空白組比較:★P<0.05；與模型組比較:▲P<0.05

表4 硝菔通結方對功能性便秘大鼠結腸組織含水率的影響±s)

注：與空白組比較:★★P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01

圖1 各組大鼠結腸AQP3的表達注：1.空白組；2.便秘模型組；3.硝菔通結方高劑量組；4.硝菔通結方中劑量組；5.硝菔通結方低劑量組；6.蓯蓉通便口服液組

表5 硝菔通結方對功能性便秘大鼠結腸組織中AQP3含量的影響

注：與空白組比較:★★P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01

4 討論

現代醫學研究表明，腎臟是人體水液代謝的核心，其對水液代謝的調節功能主要是通過影響水電解質的重吸收和分泌來實現的，腎臟的功能又受到激素的調節。在眾多的調節激素中，ALD至關重要，具有調節腎臟對鈉的重吸收、維持水平衡的作用。ALD的合成和分泌涉及RAAS系統，RAAS系統是體內分布最廣的內分泌調節系統，具有直接或間接調節水電解質的作用，其中腎素(PRA)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、血管緊張素轉化酶(ACE)為RAAS系統中的重要組成部分。PRA分泌增加可直接興奮醛固酮的分泌，從而促進其發揮保鈉保水的生理功能；另一方面作為RAAS系統的引發物，能將血漿中的血管緊張素降解，將血管緊張素原分解為AngI，通過血管緊張素轉化酶的作用轉化為AngⅡ，AngⅡ可通過協同作用促進鈉的重吸收或對鈉的轉運有直接作用調節鈉平衡[4]。同時，鹽皮質激素受體(MR)是公認的與ALD結合的特異性受體，ALD與MR結合成為復合物，并通過核膜與核中DNA特異性結合位點相互作用，調節特異性mRNA轉錄，最終合成多種醛固酮誘導蛋白，使管腔膜對Na+的通透性增大，導致對Na+的重吸收增強，對水的重吸收和K+的排出量增加，從而發揮其保鈉保水的作用[5-6]。AQPs是水分子蛋白，對維持機體水分子平衡具有重要作用，執行著各部位的水分重吸收、液體分泌和細胞內外的水平衡功能[7]。AQP3主要分布于結腸的黏膜上皮中。Yuan W T[8]等研究表明，AQP3在功能性便秘患者升結腸上表達升高，說明其在大腸內的異常表達導致結腸對水分的吸收過度，從而導致便秘的發生。錢海華[9]等經過研究證實，通便顆粒通過下調AQP3的表達，從而減少腸道對水分的吸收，增加糞便含水量來治療功能性便秘。

中醫學的病因病機體系中，便秘的發生病位在大腸，但與腎密切相關，腎的氣化功能和腎精的滋養作用有關?！饵S帝內經》中此觀點尤為突出：“腎開竅于二陰”。腎主司二便，腎氣足則氣化有度，二便排泄正常，故《黃帝內經》認為大小便異常皆與腎有關。又腎主水，腎虛不能主持津液的排泄和分布，腸道津液不足也可導致排便困難。綜上所述，功能性便秘的病機以腎虛津虧為主，故配伍用藥應以補腎益精為胃腸傳化之性提供動力，驅除濁邪以為胃腸傳化之性肅清道路，從而恢復“大腸者，傳道之官，變化出焉”。根據便秘的臨床表現以及病因病機學說，周永學教授倡導功能性便秘從腎論治，溫腎益精治其本，潤腸通腑治其標，在此基礎上創立了硝菔通結方(肉蓯蓉、當歸、芒硝、萊菔、白術)。該方參考《景岳全書》中濟川煎的組方，在張錫純硝菔通結湯基礎上加入肉蓯蓉、當歸創制而成。四藥合用，共奏溫腎益精養血、軟堅潤下通便之功。且該方另一優勢是各味藥材均不含蒽醌類成分，無導致“瀉劑結腸”之憂。經過長期臨床應用證實，其療效確切，明顯優于對照組中成藥，且未發現明顯毒副作用[10]。前期實驗研究表明，硝菔通結方治療功能性便秘療效確切，能有效糾正便秘大鼠腸道的水液代謝紊亂，然而目前從腎論治的本質及其調節水液代謝的深層機制尚不清楚。中醫學的腎為功能概念，是多體系、多臟器共同作用的結果，其具有藏精、主生殖、主水、司二便等功能，其中腎主水司二便的功能與功能性便秘的發生密切相關。腎主水司二便的功能又與現代醫學的水液代謝相對應，人體二便的產生與排泄均與水液代謝密切相關，而現代醫學的腎臟是人體水液代謝的核心，因此對腎臟水液代謝的觀察可部分反映“腎主水司二便的”的功能，從腎論治便秘有據可循。

本實驗研究結果顯示，功能型便秘大鼠血清中ALD、PRA、AngⅡ、ACE含量升高，腎臟組織中MRmRNA表達均升高，同時結腸含水率降低，結腸組織中的AQP3表達增高，說明RAAS系統的過度激活，導致ALD的合成與分泌加快，使得腎臟對水液的重吸收增加，導致腸中水液代謝也出現紊亂，從而引起便秘。硝菔通結方可使各組大鼠便秘癥狀得到明顯改善，并降低血清中ALD、PRA、AngⅡ、ACE的含量，還可下調大鼠MRmRNA水平，同時增加結腸組織的含水率，抑制結腸組織中AQP3的過度表達。此研究結果表明，腎臟能通過調節ALD合成與分泌及RAAS系統而影響腸道的水液代謝，這可能是中醫“從腎論治便秘”的科學內涵之一；硝菔通結方能通過影響ALD合成與分泌，抑制RAAS系統的過度激活，從而降低腎臟對水液的重吸收，糾正便秘大鼠腸道水液代謝紊亂而對功能性便秘發揮治療作用。但ALD與RAAS系統是否直接作用于腸道中的AQP3，其機制又是什么，還需要進一步深入的研究。

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Functional Mechanism of aldosterone(ALD) Secretion and Synthesis of Xiao Fu Tong Jie Decoction on Treating Constipation from the Kidney

LIANG Xing-chen1，ZHOU Yong-xue2△，YAN Shu-guang2，ZHANG Xiao-bo2

(1.ChengduUniversityofChineseMedicine，Chengdu610075,China; 2.ShanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang,Shanxi712046,China)

To observe the influnce that Xiao Fu Tong Jie Prescription to treat functional constipation rats from the view of aldosterone’s synthesis and secretion.From the view of the kindney adjust water metabolism,we reveal the mechanism of action of nursing functional constipation from the kindey.Methods:48 SD rats were randomly divided into blank control group(8 SD rats)and functional constipation model group(40 SD rats).All were given compound diphenoxylate for 6 weeks and then divided into Xiao Fu Tong Jie Prescription high, medium, low dose group and positive drug group(Cong Rong Tong Bian oral liquid).These treatment groups were treated with different dose of Xiao Fu Tong Jie Prescription. Positive drug group was treated with Cong Rong Tong Bian oral liquid.All for one month. Observed the general condition of each group and the water content of the colon.The protein expression of the aldosterone(ALD)、renin(PRA)、angiotensinⅡ(AngⅡ)、angiotensin-converting enzyme(ACE)by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). The mRNA and protein expression of MR were determined by Real-time PCR. The protein expression of the Western blot were used to detect the expression of AQP3 in colon. Results：Compared with the blank control group,the rats of model group had less feces and texture was hard.The water content of the colon levels were significantly decreased.ALD、PRA、AngⅡ、ACE content were increased.MR mRNA relative expression levels were increased. Levels of AQP3 relative expression levels were significantly increased；Compared with the model group,the rats of treatment groups had more feces and texture was loose.The water content of the colon levels were significantly increased.ALD、PRA、AngⅡ、ACE content were decreased.MR mRNA relative expression levels were decreased. Levels of AQP3 relative expression levels were significantly decreased after giving Xiao Fu Tong Jie Prescription and Cong Rong Tong Bian oral liquid.Conclusions:The kidney can affect water metabolism disorder in colon by adjusting ALD’s synthesis and secretion.This may be one of the scientific connotation of nursing functional constipation from the kindey；Xiao Fu Tong Jie Prescription can affect water metabolism disorder in colon by adjusting ALD’s synthesis and secretion to nursing functional constipation.

Xiao Fu Tong Jie Prescription；Functional Constipation；ALD；RAAS

國家自然科學基金資助項目(81273663)-基于VIP-CAMP-PKA-AQP3通路的硝菔通結方治療功能性便秘的作用機制研究；國家課題重大專項(2012ZX09103201-037)-硝菔通結丸研制

梁星琛(1987-)，女，陜西咸陽人，在讀博士,從事中醫方劑學的臨床與研究。

△通訊作者：周永學，教授，博士研究生導師，從事方劑配伍基礎與臨床研究，Tel:18691068166,E-mail: zhou8521@163.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)02-0338-04

2016-06-12