益艾康及HAART治療對HIV感染者輔助受體CCR5/CXCR4表達的影響*

劉 真，李 強，鄧博文，李承乘，桑 鋒，徐立然

(河南中醫藥大學第一附屬醫院艾滋病臨床研究中心，河南省病毒性疾病中醫藥防治重點實驗室，鄭州 450000)

益艾康及HAART治療對HIV感染者輔助受體CCR5/CXCR4表達的影響*

劉 真，李 強，鄧博文，李承乘，桑 鋒，徐立然△

(河南中醫藥大學第一附屬醫院艾滋病臨床研究中心，河南省病毒性疾病中醫藥防治重點實驗室，鄭州 450000)

目的：探討益艾康及HAART治療對艾滋病病毒感染者輔助受體CCR5/CXCR4表達的影響及輔助受體表達與HIV疾病進展的關系。方法：收集65例HIV感染者及10例健康對照抗凝全血，采用流式細胞技術檢測各樣本T細胞表面CCR5、CXCR4表達水平。HIV感染者按治療情況分為未治療組、益艾康治療組、益艾康合并HAART治療組3組，比較不同組別間輔助受體表達水平。結果：HIV感染組CD4+T淋巴細胞表面CCR5表達高于對照組，CXCR4表達低于對照組。相關分析顯示，CCR5表達與CD4+T細胞數成負相關，與病毒載量成正相關；CXCR4表達與CD4+T細胞數成正相關，與病毒載量成負相關。HIV感染者不同治療組輔助受體表達水平結果顯示，益艾康治療可部分恢復輔助受體的表達水平，HAART治療可增強益艾康療效。結論：益艾康治療可降低艾滋病感染者輔助受體CCR5的表達，增加輔助受體CXCR4的表達，可部分改善艾滋病病毒感染后的免疫損傷。 關鍵詞： 人類免疫缺陷病毒；益艾康；CC趨化因子受體5；CXC趨化因子受體4

艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)，是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染引起的以T淋巴細胞免疫功能缺陷為主的一種免疫缺陷病[1]，HIV-1感染人體除通過結合T細胞表面的CD4分子外，還需和輔助受體相結合才能進入靶細胞，HIV-1病毒株進入細胞的輔助受體主要有CCR5和CXCR4[2]。目前基于HIV/AIDS感染后CD4+、CD8+T細胞表面CCR5和CXCR4的表達情況研究報道較多，但學者們并未取得統一性結論[3-4]。益艾康膠囊是治療艾滋病的臨床經驗方，已在國家中醫藥管理局艾滋病救治項目(河南)中推廣使用。臨床研究表明，該制劑具有健脾益氣、養血解毒之功效，在臨床推廣中顯著提高了艾滋病患者的免疫力[5-6]。本研究以不同治療方案的HIV感染者作為研究對象，分析T細胞表面輔助受體表達水平與HIV疾病進展關系以及不同治療方案人群輔助受體的表達情況，探討益艾康治療對艾滋病病毒感染引起免疫損傷的重建作用，從輔助受體的角度初步了解益艾康的作用機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2011年3月至2013年12月在河南中醫學院第一附屬醫院艾滋病門診收治的經河南省疾病預防控制中心確診的HIV-1感染者，診斷均符合2011版本的艾滋病診療指南[7]。回顧性分析65例病人的治療情況，其中未治療組11例，益艾康治療組32例，益艾康合并HAART治療組22例，病人的主要病癥有發熱、咳嗽、腹瀉、乏力、納呆、皮疹等。未治療組未服用任何藥物；益艾康治療組服用益艾康，服用方法為每日3次，每次5粒，療程6個月以上；益艾康合并HAART治療組在口服HAART藥物的基礎上服用益艾康膠囊。健康對照人群10例，全部來自河南中醫學院第一附屬醫院健康體檢者，這幾組人群在性別和年齡是均衡可比的。所有樣品均在受試對象知情同意的情況下采集靜脈血。

1.2 CD4+T淋巴細胞絕對計數檢測

已標記好的Trucount管中加入20 μl 抗- FITC-CD3、抗-PE-CD4、抗-PerCP-CD45、抗- APC-CD8混合抗體(BD公司)，后加入50 μl充分混勻的全血，振蕩混勻，室溫避光20 min。然后加入450 μl 1 × FACS裂解液，立即振蕩混勻，室溫避光裂解10 min至溶液澄清。利用FACS Calibur流式細胞儀進行檢測，采用MultiSet軟件收集細胞并同時進行分析，得到淋巴細胞亞群相對及絕對計數。

1.3 血漿病毒載量測定

采用COBAS AMPLICOR HIV-1定量檢測試劑盒(Roche公司)在COBAS AMPLICOR全自動PCR檢測儀上定量測定感染者血漿中HIV-1 RNA含量，病毒載量檢測下限為20 copies/ml。

1.4 T淋巴細胞表面輔助受體CCR5、CXCR4表達水平的測定

取100 μL EDTA抗凝新鮮外周血，加入10 μL FITC-CD8 Ab(BD)、5 μL PE-Cy7-CD4 Ab(BD)、5 μL PE-CXCR4 Ab(BD)、5 μLAPC-CCR5 Ab(BD)。混勻后室溫避光標記20 min，然后加入2 ml溶血素，立即振蕩混勻，室溫避光10 min至溶液澄清，1500 r/min離心10 min(離心半徑為13.5 cm)，除去未結合的熒光抗體，后洗滌細胞(2ml PBS，1500 r/min離心10 min)，將染色好的細胞重懸于300 μL的PBS中，用BD CantoⅡ流式細胞儀獲取數據，Flowjo軟件分析CCR5+/CD4+、CXCR4+/CD4+、CCR5+/CD8+、CXCR4+/CD8+表達水平。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 健康人群與HIV感染者CD4絕對計數、血漿病毒載量、輔助受體表達情況比較

表1顯示，HIV-1感染者CD4+T淋巴細胞計數低于健康人群，差異有統計學意義(P=0.01)；健康人群CD4+T淋巴細胞表面CCR5水平低于HIV感染人群(P=0.038)，CXCR4表達水平高于HIV感染人群，差異有統計學意義(CXCR4+/CD4+，P=0.015；CXCR4+/CD8+，P<0.001)。HIV感染者血漿病毒載量均值(中位數)為11000 copies/ml，四分位間距(21.8，36050)。

表1 健康人群與HIV感染者CD4絕對計數、輔助受體表達水平比較±s)

2.2 HIV-1感染者CCR5+/CD4+、CXCR4+/CD4+、CCR5+/CD8+、CXCR4+/CD8+表達水平與疾病進展的相關性

為研究HIV感染者外周血輔助受體的變化特征，探討其是否與HIV疾病進展和病毒復制具有相關性。本研究分析了感染者體內CCR5+/CD4+、CXCR4+/CD4+、CCR5+/CD8+、CXCR4+/CD8+表達水平與CD4+T淋巴細胞計數和病毒載量的關系。結果顯示，CCR5+/CD4+、CCR5+/CD8+與CD4+T細胞數成負相關，與病毒載量成正相關；CXCR4+/CD4+、CXCR4+/CD8+與CD4+T細胞數成正相關，與病毒載量成負相關。雖僅有3組變量之間差異有統計學意義，但所有均有相關的趨勢(見圖1)。

圖1 HIV-1感染者輔助受體表達水平與CD4+T淋巴細胞計數和病毒載量的相關性

2.3 不同治療方案人群輔助受體CCR5、CXCR4表達水平的比較

為揭示益艾康及HAART治療對輔助受體表達的影響，我們分析了不同治療方案組別之間輔助受體CCR5、CXCR4表達水平。結果顯示，隨著組別的依次遞增，CCR5+/CD4+(%)逐漸下降，CXCR4+/CD4+(%)和CXCR4+/CD8+(%)逐漸上升。CCR5+/CD4+(%)、CXCR4+/CD4+(%)和CXCR4+/CD8+(%)的表達在4組之間存在統計學差異(具體兩兩比較見表2)。研究結果顯示，益艾康治療可部分恢復輔助受體的表達水平，HAART治療可增強益艾康的療效作用。

表2 不同治療方案人群輔助受體CCR5、CXCR4表達水平的比較±s)

注：與健康對照組比較:#P<0.05；與未治療組比較:▲P<0.05；與益艾康治療組比較:■P<0.05

3 討論

艾滋病自1981年美國首次報道以來，人們不斷研究它的發病原因、病理機制和防治方法。1996年[8]人體趨化因子受體5(CCR5)的成功克隆，使人們發現在感染初期，HIV-1感染人體除通過結合T細胞表面的CD4分子外，還需結合輔助受體CCR5才可感染并進入靶細胞。隨著研究的進一步深入,越來越多的輔助受體被證實與HIV感染有關。

趨化因子受體主要分布在機體免疫細胞表面，屬于G蛋白偶聯受體，具有7個跨膜片段。趨化因子受體與相應的趨化因子結合，通過和異源三聚體的G蛋白結合來傳遞信息，誘導免疫細胞向趨化因子的來源部位移動。根據結合的配體分為3個亞家族，即CXC類受體(CXCR)、CC類受體(CCR)和配體尚未明確的孤兒受體。HIV-1病毒株進入細胞的輔助受體主要為CCR5和CXCR4，此外少數病毒還可利用CCR2和CCR3等。 根據HIV-1感染不同細胞的能力將病毒分為巨噬細胞噬性病毒(M-tropic)、T細胞噬性病毒(T-tropic)和雙重噬性病毒(Dual-tropic)。M嗜性病毒感染巨噬細胞和原始T細胞，但并不感染大多數傳代T細胞系；T嗜性病毒能夠感染原始T細胞和傳代T細胞系，但并不感染巨噬細胞。HIV-1的細胞嗜性與輔助受體的利用有密切關系，M-tropic是無癥狀患者攜帶的主要病毒，主要利用CCR5又稱為R5毒株，在病毒傳播中起主要作用。T-tropic主要利用的輔助受體為CXCR4，稱為X4毒株。Dual-tropic既可利用CCR5，又可利用CXCR4，被稱為R5X4病毒株[9-10]。

目前基于HIV/AIDS感染后CD4+、CD8+T細胞表面CCR5和CXCR4的表達情況的研究報道較多，但研究者并未取得統一性結論[3-4]。有研究提示，我國HIV/AIDS患者CD4+、CD8+T細胞表面CCR5表達增高，CD8+T細胞表面CXCR4表達下降。傳統的抗病毒治療可影響HIV-1輔助受體的利用情況及輔助受體的表達水平。在治療人群中，X4毒株的利用要高于非治療人群和新近感染人群，在未治療人群中CD4計數的下降與輔助受體的轉化有關，但經過CD4計數的標準化處理后，治療人群的X4利用率仍然要高于未治療人群。本研究總結分析了65例HIV-1感染者的輔助受體與CD4+T淋巴細胞計數和血漿病毒載量的關系，并探討其表達水平的變化與HIV-1感染疾病進展的關系。本研究是基于HIV不同治療方案的臨床試驗，深入探討了不同治療方案HIV感染者輔助受體CCR5/CXCR4的表達水平，結果真實可信。

本研究結果表明，HIV-1感染后T細胞表面CCR5和CXCR4的表達與疾病進展和機體免疫反應密切相關，益艾康治療可能會在一定程度上改善機體免疫功能，從而影響CD4+、CD8+T淋巴細胞表面CCR5和CXCR4的表達水平。HIV感染導致輔助受體表達水平變化的確切機制目前尚不明確，可能與HIV感染后引起機體應激性異常免疫反應有關。第二受體CCR5主要表達在活化的淋巴細胞表面，而CXCR4則主要表達在靜息細胞表面。在HIV感染中，淋巴細胞表面CD38和HLA-DR表達上升，活化明顯增高，因而導致輔助受體CCR5表達相應增高，CXCR4表達降低[11]。但HIV感染引起輔助受體變化的確切機制還有待進一步研究。

綜上，隨著疾病進展，HIV感染者淋巴細胞表面第二受體的表達出現了明顯的變化，檢測CD4+T淋巴細胞計數，同時結合輔助受體的變化，可能會更好地反映HIV感染者的免疫狀態。益艾康治療可部分恢復受體的變化，改善病人的免疫損傷，這為益艾康的作用機制研究提供了思路。

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Effect of Yiaikang and HAART on coreceptor CCR5/CXCR4 expression in HIV infectors

LIU Zhen, LI Qiang, DENG Bo-wen, LI Cheng-cheng, SANG Feng, XU Li-ran△

(KeyLaboratoryofViralDiseasePreventionandTreatmentofTCMofHenanProvince,DepartmentofAcquiredImmuneDeficiencySyndromeTreatmentandResearchCenter,theFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTCM,Zhengzhou450000,China)

Objective To study the effects of Yiaikang and highly active antiretroviral therapy (HAART) on coreceptor CCR5/CXCR4 expression and to investigate the relationship between the coreceptor expression and HIV disease progression. Methods:Enrolled 65 cases of HIV infected persons and 10 cases of healthy control, T cell surface CCR5/ CXCR4 expression levels were measured by flow cytometry. According to therapeutic method HIV infectors were divided into three groups: untreated group, Yiaikang treatment group, Yiaikang with HAART treatment group, coreceptor expression levels of different groups were compared. Results The expression of CCR5 in CD4+T cell surface of HIV infection group was higher than that of the control group; while HIV infection group coreceptor CXCR4 expression was lower than that of control group. Correlation analysis showed that CCR5 expression correlated negatively with CD4+T cell count and positively with viral load; CXCR4 expression correlated positively with CD4+T cell count and negatively with viral load. Comparing results of coreceptor expression levels in HIV different treatment groups showed Yiaikang treatment can partially restore the coreceptor expression levels and HAART can enhance the effect of Yiaikang. Conclusion:Yiaikang therapy can reduce coreceptor CCR5 expression, increase the expression of the CXCR4 coreceptor in HIV infectors,resultly partially improve the immune injury caused by AIDS virus infection.

Human immunodeficiency virus; Yiaikang; CCR5; CXCR4

河南省科技攻關計劃(142102310511)；祛毒顆粒體外抗HIV-1病毒活性研究；鄭州市科技攻關計劃(20130991)；PD-1和Tim-3在HIV感染時增強表達的機制及扶正療法對其表達水平變化的影響；河南中醫學院科研苗圃工程項目(MP2013-13)；益艾康治療對HIV-1感染者輔助受體CCR5、CXCR4表達水平的影響；河南省高等學校重點科研項目(15A360029)-基于Toll樣受體通路探討益元康治療艾滋病的療效機制研究；河南省中醫藥防治艾滋病專項(2012ZK07)；益艾康膠囊對HIV/AIDS患者淋巴細胞受體多樣性變化的影響；河南省中醫藥科學研究專項(2015ZY02096)；清肺培元法對艾滋病合并肺部感染患者TH1/TH2免疫穩態的調控作用研究

劉 真(1985-)，女，河南鄭州人，主管技師，醫學碩士，從事艾滋病免疫學的臨床與研究。

△通訊作者：徐立然，主任醫師，教授，博士研究生導師，從事艾滋病中醫藥防治的臨床與研究，Tel:0371-66288898,E-mail:xuliran666666@sina.com。

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1006-3250(2017)03-0375-03

2016-08-08