氯通道在三氧化二砷誘導鼻咽癌細胞凋亡中的作用*

呂瑞玲， 高 宏， 鄧志欽， 王海波， 梁協稠, 譚秋蟬， 朱林燕， 王立偉△， 陳麗新△

(暨南大學基礎醫學院 1生理學系， 2藥理學系， 廣東 廣州 510632 )

氯通道在三氧化二砷誘導鼻咽癌細胞凋亡中的作用*

呂瑞玲1， 高 宏2， 鄧志欽1， 王海波2， 梁協稠1, 譚秋蟬1， 朱林燕2， 王立偉1△， 陳麗新2△

(暨南大學基礎醫學院1生理學系，2藥理學系， 廣東 廣州 510632 )

目的： 探討氯通道在三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)誘導人鼻咽癌CNE-2Z細胞凋亡中的作用。方法： 采用流式細胞術檢測CNE-2Z細胞經As2O3作用24及48 h的凋亡率；應用膜片鉗技術記錄As2O3激活的細胞膜電流，并分析其電流特性；采用流式細胞術檢測氯通道阻斷劑DIDS 對As2O3誘導的CNE-2Z細胞凋亡的抑制作用。結果： (1) 5 μmol/L As2O3能夠時間依賴性地誘導的CNE-2Z 細胞凋亡；(2) CNE-2Z細胞外灌流含5 μmol/L As2O3的等滲溶液能夠激活一個具有外向整流特征的電流，激活的電流無明顯的時間及電壓依賴性失活，翻轉電位接近氯平衡電位；(3) As2O3激活的電流能夠被氯通道阻斷劑DIDS 和NPPB 完全抑制，細胞外灌流47% 的高滲溶液能夠完全抑制As2O3激活的電流；(4) 氯通道阻斷劑DIDS 能夠抑制As2O3誘導的CNE-2Z細胞凋亡。結論： As2O3可以激活CNE-2Z細胞的容積敏感性氯通道。氯通道在As2O3誘導的CNE-2Z凋亡中發揮重要作用。

氯通道； 三氧化二砷； 鼻咽癌； 細胞凋亡

三氧化二砷(As2O3)是中藥砒霜的主要有效成分，國內外已先后將As2O3應用于其它血液系統腫瘤和實體瘤的治療，并研究發現其能誘導多種腫瘤細胞凋亡[1-2]。鼻咽癌是中國南方、東南亞一帶高發的惡性腫瘤，具有高轉移性的特征。放療是治療鼻咽癌的基本方法，但放療后易出現遠處轉移及局部復發，因此尋找有效的治療鼻咽癌藥物具有重大意義。研究發現經三氧化二砷治療后，人鼻咽低分化鱗癌細胞CSNE-1小鼠移植瘤發生凋亡和分化現象[3]。將As2O3應用于高分化鼻咽癌細胞CNE- 1 中，研究發現其對CNE-1細胞有明顯的放射增敏效應，其機制可能與As2O3使其細胞凋亡增加有關[4]，表明As2O3對鼻咽癌具有治療作用。

氯離子通道是一種重要的陰離子通道，廣泛分布于機體的興奮性和非興奮性細胞膜，以及各種細胞器的膜性結構中。氯離子通道參與多種生理以及病理生理過程，如細胞增殖、凋亡、容積調節、物質轉運、細胞遷移等。我們的研究發現氯離子通道在細胞凋亡中具有重要作用[5-9]。然而，氯離子通道在As2O3誘導的鼻咽癌細胞凋亡之中發揮何種作用，尚缺乏深入的研究。因此，本研究對三氧化二砷進行體外實驗研究，觀察其對人低分化鼻咽癌細胞凋亡的影響，研究其抗癌機制，探討氯離子通道在三氧化二砷抗腫瘤中的作用。

材 料 和 方 法

1 細胞

本課題的研究對象為人鼻咽癌上皮細胞株CNE-2Z，由廣東醫學院病理教研室惠贈后于本室長期保存。復蘇細胞后，取第3代生長至對數期時的細胞用于進一步實驗。

2 主要試劑

三氧化二砷購于北京雙鶩藥業股份有限公司，用蒸餾水配制成10 mmol/L的儲存溶液。氯通道阻斷劑DIDS和NPPB購于Sigma，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO) 配制成100 mmol/L的儲存液，使用前用等滲灌流液稀釋至100 μmol/L。Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。

3 主要方法

3.1 細胞培養 CNE-2Z細胞用含10 %新生小牛血清、1×105IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養液常規培養在37 ℃、飽和濕度、5%、CO2培養箱內。CNE-2Z細胞每隔48 h傳代1次。電流記錄實驗前用0.25%的胰酶消化CNE-2Z細胞制成單細胞懸液，將細胞懸液接種于22 mm的圓形玻片上，置于細胞培養箱內約60 min，待細胞貼壁后即可做膜片鉗實驗。

3.2 細胞凋亡檢測 取對數生長期的細胞，制成細胞懸液，計數后接種于6孔板中，并調整細胞濃度為8.0×107/L，每孔總體積為2 mL，并將細胞置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養箱中培養過夜。次日加藥培養一定時間后，用胰酶消化，將細胞吹打均勻，并收集細胞，1 000 r/min離心 5 min；用冷 PBS 重懸、洗滌、離心 3 次； 用500 μL Binding Buffer 重懸細胞，分別加入 Annexin V-FITC，PI 各 5 μL，室溫避光孵育 5～15 min；孵育后 1 h 內使用流式細胞儀(BD)進行檢測，FL1通道檢測FITC 熒光強度，FL3通道檢測PI 熒光強度。

3.3 膜片鉗實驗

3.3.1 細胞灌流液 等滲灌流液(isotonic solution，滲透壓為300 mOsm/L)成分為(mmol/L)： 70 NaCl，0.5 MgCl2， 2 CaCl2， 10 HEPES，140 D-mannitol； 高滲灌流液(47% hypertonic solution，滲透壓440 mOsm/L)，溶液所含成分與等滲液相同，不同的是含D-mannitol 280 mmol/L，其它成分的量與等滲液相同。各成分溶解完全后用冰點滲透壓計(Osmomat 030)測定滲透壓，用Tris 堿調pH 至7.4。

3.3.2 電極內液 記錄氯電流所用電極內液成分為(mmol/L)：70 NMDG-Cl, 1.2 MgCl2，1 EGTA，10 HEPES, 140 D-mannitol， 2 ATP。用Tris 堿調pH 至7.25，滲透壓調至300 mOsm/L。

3.3.3 全細胞膜片鉗記錄 用微電極拉制器拉制電極，拉制好的電極灌入電極內液后，微電極尖端的電阻為5～10 MΩ。為了使不同細胞的電流具有可比性，計算電流密度，電流密度的公式為：電流密度(pA/pF)=全細胞電流值(pA)/細胞電容(pF)。實驗過程中調節G-SERIS和C-SLOW旋紐補償電容性電流，其盡可能減少，即電流趨近于方波型時,其補償值的大小即為該細胞膜電容。用EPC-7膜片鉗放大器(HEKA)記錄單細胞的全細胞氯電流。用轉換器(CED1401)采集電流和電壓信號，采樣頻率為3 KHz。全細胞電壓鉗制在0、±40以及±80 mV，反復循環，脈沖波寬設置為200 ms，脈沖間隔為4 s。用EPC軟件記錄并分析數據。

把準備好的細胞玻片用非熔性油脂貼附在灌流槽中，再安裝在倒置相差顯微鏡的載物平臺上，全細胞記錄方式記錄CNE-2Z細胞膜電流。記錄等滲下穩定的背景電流約3 min，換5 μmol/L的As2O3胞外灌流，觀察并記錄激活電流的潛伏期、電流密度等。電流達到峰值并穩定后，加入100 μmol/L的氯通道阻斷劑DIDS或NPPB，觀察阻斷劑對激活電流的影響。計算氯通道阻斷劑對As2O3激活電流的抑制率。抑制率的計算公式為：[(Cmax-CIso)-(CBlockers-CIso)]/(Cmax-CIso) ×100%，其中CIso是等滲溶液中細胞的基礎電流值，Cmax是As2O3激活的電流最大值，CBlockers是加入阻斷劑后的最大效應時的電流值。

4 統計學處理

采用SPSS 13.0 軟件進行統計分析，數據均采用均數±標準誤(mean±SEM)表示，根據實驗情況，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，每項實驗至少重復3次，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 As2O3誘導CNE-2Z細胞凋亡

CNE-2Z細胞在含5 μmol/L As2O3的培養基中培養24 h或48 h后，胰酶消化細胞后，用Annexin V-FITC/PI染料雙染細胞，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果顯示，5 μmol/L As2O3作用CNE-2Z細胞24 h后，細胞凋亡率為(20.30±0.67)%。5 μmol/L As2O3作用CNE-2Z細胞48 h后，細胞凋亡率為(38.77±2.20)%,見圖1。這表明As2O3可誘導CNE-2Z細胞凋亡；As2O3作用CNE-2Z細胞主要導致中、晚期凋亡,以及少量細胞的壞死；As2O3誘導CNE-2Z細胞凋亡具有時間依賴性。

Figure 1.As2O3induced apoptosis of CNE-2Z cells. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖1 As2O3誘導CNE-2Z細胞凋亡

2 As2O3激活CNE-2Z細胞電流

當在細胞外灌流等滲溶液時，細胞的基礎電流很小，在+80 mV電壓鉗制下，細胞的外向電流密度為(3.57±0.47) pA/pF, 在-80 mV電壓鉗制下，細胞的外向電流密度為(-3.64±0.48) pA/pF。當在細胞外灌流5 μmol/L的As2O3溶液時，可以明顯激活一個電流，其潛伏期為(2.45±0.63) min。激活的電流具有明顯的外向整流特征，但無明顯的時間及電壓依賴性失活。外向電流為(38.81±1.72) pA/pF，而內向電流為(-29.26±1.17) pA/pF。該激活電流的翻轉電位為(-4.27±1.21) mV,接近本實驗條件下氯離子平衡電位的理論值-0.9 mV，提示As2O3激活CNE-2Z細胞的電流為氯電流，見圖2。

3 氯通道阻斷劑DIDS對氯電流的抑制作用

DIDS是常用的氯通道阻斷劑，100 μmol/L的DIDS能夠完全抑制5 μmol/L的As2O3激活的電流。在+80 mV電壓鉗制下，DIDS使細胞的外向電流密度從(39.22±4.04) pA/pF降至(3.17±1.17) pA/pF (P<0.01)，抑制率達(101.21±1.33)%；在-80 mV電壓鉗制下，DIDS使細胞的內向電流密度從(-27.10±1.39) pA/pF降至(-3.40±1.56) pA/pF (P<0.01)，抑制率達(97.93±12.90)%，DIDS對內、外向電流的抑制作用無明顯的差異，見圖3。

Figure 2.As2O3activated currents in CNE-2Z cells. A: the time course of As2O3-activated currents in CNE-2Z cells; B: the current-voltage relationship of As2O3-activated currents in CNE-2Z cells; C: traces of background currents recorded in the isotonic solution (Iso); D： traces of As2O3-activated currents. Cells were clamped at 0, ±40 mV and ±80 mV repeatedly. Mean±SEM.n=15.**P<0.01vsIso.

圖2 As2O3激活CNE-2Z細胞電流

Figure 3.Inhibition of As2O3-induced currents by the chloride channel blocker DIDS. A: the time course of inhibition of As2O3-induced currents by DIDS; B: current-voltage relationship; C: traces of As2O3-induced currents; D: current traces showing inhibition of the currents by DIDS. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsAs2O3+DIDS.

圖3 氯通道阻斷劑DIDS對氯電流的抑制作用

4 氯通道阻斷劑NPPB對氯電流的抑制作用

NPPB也是一種常用的氯通道阻斷劑，100 μmol/L的NPPB能夠完全抑制5 μmol/L As2O3激活的電流。在+80 mV電壓鉗制下，NPPB使細胞的外向電流密度從(38.49±3.75) pA/pF降至(2.50±2.14) pA/pF(P<0.01),其抑制率為(104.18±4.72)%；在-80 mV電壓鉗制下，NPPB使細胞的內向電流密度從(-31.18±3.00) pA/pF降至(-2.85±1.43) pA/pF(P<0.01),其抑制率為(104.26±4.02)%，NPPB對內、外向電流的抑制作用無明顯的差異，見圖4。

Figure 4.Inhibition of As2O3- induced currents by the chloride channel blocker NPPB. A: the time course of inhibition of As2O3-induced currents by NPPB; B: current-voltage relationship; C: traces of As2O3- induced currents; D: current traces showing inhibition of the currents by NPPB. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsAs2O3+NPPB.

圖4 氯通道阻斷劑NPPB對氯電流的抑制作用

5 As2O3激活的電流具有容積敏感性

5 μmol/L的As2O3能夠激活一個外向優勢的電流，當該電流平穩后，穩定灌流含5 μmol/L的As2O3的440 mOsm/L的高滲溶液(Hyper)，激活的電流被快速且完全地抑制。在+80 mV電壓鉗制下，Hyper使細胞的外向電流密度從(37.73±2.11) pA/pF降至(5.50±1.24) pA/pF(P<0.01 )，其抑制率為(94.85±0.79)%；在-80 mV電壓鉗制下，Hyper使細胞的內向電流密度從(-29.50±1.18) pA/pF降至(-4.93±1.07) pA/pF(P<0.01 )，其抑制率為(96.06±4.17)%，高滲溶液對內、外向電流的抑制作用無明顯的差異。在高滲環境下，細胞皺縮，細胞容積變小，導致As2O3激活的氯通道被關閉，提示As2O3激活的電流具有明顯的容積敏感性，見圖5。

6 氯通道阻斷劑DIDS 對As2O3誘導凋亡的抑制作用

為明確氯通道是否參與 As2O3誘導的 CNE-2Z 細胞凋亡，預先用氯通道阻斷劑DIDS(100 μmol/L)作用于細胞 25 min，然后換用DIDS(50 μmol/L)和As2O3(5 μmol/L)共同作用于 CNE-2Z 細胞 24 h。結果顯示，DIDS 能夠顯著抑制 As2O3誘導的 CNE-2Z 細胞的凋亡作用，凋亡率從 (20.30±0.67)%下降至 (7.70±1.17)%，與 As2O3組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。而單用 50 μmol/L DIDS 組的凋亡率為(2.70±0.31)%，與空白對照組的凋亡率(2.50±0.53)%相比，無顯著差異。以上結果提示氯通道參與了 As2O3誘導的 CNE-2Z 細胞凋亡，見圖6。

Figure 5.Inhibition of As2O3-induced currents by the 47% hypertonic solution (Hyper). A: the time course of inhibition of As2O3-induced currents by Hyper; B: current-voltage relationships; C: traces of As2O3-induced currents; D: current traces showing inhibition currents by Hyper. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsAS2O3+Hyper.

圖5 高滲溶液對氯電流的抑制作用

Figure 6.Attenuation of As2O3-induced apoptosis of CNE-2Z by DIDS. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsAs2O3+DIDS.

圖6 氯通道阻斷劑DIDS 對As2O3誘導凋亡的抑制作用

討 論

三氧化二砷作為砒霜的主要有效成分，已成功運用于治療白血病和某些惡性腫瘤[1, 10-13]，如鼻咽癌，前列腺癌，膀胱癌，乳腺癌等。三氧化二砷被廣泛應用于腫瘤疾病的臨床治療中，是一種前景樂觀的抗腫瘤藥物。眾多臨床研究表明，誘導腫瘤細胞凋亡是三氧化二砷抗癌或抑癌作用的主要作用機制。細胞凋亡指為維持內環境穩定，由基因控制的、細胞自主的、有序的死亡。細胞在發生凋亡的過程中具有明顯的形態學改變, 包括細胞膜發泡, 細胞皺縮, 線粒體膜電位下降, 染色體凝聚和DNA片段化等。在凋亡誘導劑誘導癌細胞凋亡的過程中，凋亡早期鉀通道和氯通道會被激活，同時伴隨水的外流，導致凋亡性容積減小(apoptotic volume decrease, AVD)。應用氯通道阻斷劑可以抑制AVD的發生，從而抑制細胞凋亡[14]。我們的前期研究表明，在過氧化氫誘導腎上腺嗜鉻細胞瘤 PC12 細胞的凋亡過程[15]以及順鉑[16]、紫杉醇[5]、華蟾酥毒基[6]誘導鼻咽癌 CNE-2Z 細胞凋亡的過程中，氯通道均發揮了重要的作用。但是三氧化二砷對鼻咽癌的抗癌作用是否與氯通道有關，目前尚不清楚。本研究旨在觀察三氧化二砷對人低分化鼻咽癌細胞凋亡的影響，研究其抗癌機制，探討氯離子通道在三氧化二砷抗腫瘤中的作用，加深對三氧化二砷抗癌機制的認識。

本實驗結果表明As2O3在體外能夠時間依賴性地誘導CNE-2Z細胞凋亡，應用全細胞膜片鉗記錄模式，直接觀察As2O3對CNE-2Z細胞氯通道的影響，結果顯示As2O3可以激活CNE-2Z細胞具有外向整流特征的電流，激活的電流無明顯的時間及電壓依賴性失活，翻轉電位接近氯平衡電位，并且該激活電流能夠被氯通道阻斷劑DIDS 和NPPB 完全抑制，進一步表明As2O3激活的電流為氯電流。細胞外灌流47%的高滲溶液能夠完全抑制As2O3激活的電流，表明激活的電流具有容積敏感性。

DIDS 和NPPB皆為常用的有效氯通道阻斷劑，并且從膜片鉗實驗結果可知NPPB對As2O3激活的電流的抑制作用略高于DIDS的抑制作用。為了進一步證實在As2O3誘導CNE-2Z細胞凋亡過程中，氯通道具有重要作用，選取氯通道阻斷劑DIDS 與As2O3共同作用于CNE-2Z細胞，通過流式檢測細胞凋亡率。結果顯示，單純應用氯通道阻斷劑DIDS無誘導細胞毒作用， DIDS 與As2O3共同作用組相比于As2O3處理組細胞凋亡率明顯降低，表明氯通道阻斷劑DIDS能夠有效抑制As2O3誘導的CNE-2Z細胞凋亡，抑制氯通道后能夠逆轉As2O3對CNE-2Z細胞的凋亡作用，進一步證實在As2O3誘導CNE-2Z細胞凋亡過程中，氯通道具有重要作用。

研究發現As2O3處理CNE-2Z細胞后，調節細胞凋亡的關鍵基因bax的表達明顯增多，而bcl-2的表達無明顯變化，CNE-2Z細胞的線粒體膜電位降低[17]。細胞線粒體膜電位的降低表明線粒體膜通透性轉運孔的開放，導致線粒體釋放caspase活化物，從而引起細胞凋亡[18]。目前研究發現細胞內氯通道家族成員中，只有CLIC4在線粒體上表達，因此也將CLIC4 稱之為線粒體細胞內氯通道 (mitochondrial chloride intracellular channel，mtCLIC)，高表達CLIC4后可激活caspase，促進細胞的凋亡[19]，表明氯通道CLIC4參與了線粒體膜電位的降低，導致caspase的活化和細胞的凋亡，提示As2O3也有可能通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。此外氯通道在維持細胞正常pH中發揮重要作用，當氯離子通道被過度激活后，細胞內的pH值改變將影響到細胞內的代謝動力學過程，如果與調節細胞增殖、分化和生存相關的信號調節蛋白發生改變或損害，將誘發許多病理生理過程的發生，從而有可能啟動或促進細胞的凋亡過程。細胞凋亡過程中會伴有細胞骨架系統的改變，細胞骨架微絲主要由肌動蛋白組裝的多聚體和肌動蛋白結合蛋白組成，其組裝或解聚與細胞的許多功能活動相關[20]，有文獻報道，細胞經一定濃度的As2O3處理后，F-actin顯著減少，表明As2O3通過改變細胞內的微絲結構從而改變細胞骨架，細胞骨架的改變可降低細胞遷移及黏附能力，使貼壁細胞易于脫落，從而降低腫瘤細胞轉移、侵襲和增殖的能力，從而產生抗癌或抑癌的作用[21]，我們前期結果表明CNE-2Z細胞經紫杉醇處理后，氯通道蛋白明顯增多，細胞膜表面粗糙度增加，提示膜蛋白顆粒聚集，且細胞膜彈性也變差，細胞膜上氯通道表達以及分布改變可能是造成細胞膜物理特性變化的原因之一[5]，提示As2O3可能通過影響細胞膜上的氯通道來改變細胞骨架，從而促進細胞凋亡。

綜上所述，As2O3能夠時間依賴性地誘導CNE-2Z細胞凋亡，能夠激活CNE-2Z細胞的容積敏感性氯通道，氯通道阻斷劑DIDS 能夠抑制As2O3誘導的CNE-2Z細胞凋亡，表明氯通道在As2O3誘導CNE-2Z凋亡中具有重要作用。氯通道如何在As2O3誘導細胞凋亡過程中起作用的，這一問題有待進一步研究。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Role of chloride channels on apoptosis of CNE-2Z cells induced by arsenic trioxide

Lü Rui-ling1, GAO Hong2, DENG Zhi-qin1, WANG Hai-bo2, LIANG Xie-chou1, TAN Qiu-chan1, ZHU Lin-yan2, WANG Li-wei1, CHEN Li-xin2

(1DepartmentofPhysiology,2DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:twangliwei@jnu.edu.cn;tchenlixin@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the role of chloride channels in the apoptosis of human poorly differentiated nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells induced by arsenic trioxide (As2O3). METHODS: The apoptotic rates of CNE-2Z cells induced by As2O3for 24 h or 48 h were monitored by flow cytometry. The technique of whole-cell patch clamp was used to record the currents activated by As2O3in the CNE-2Z cells. The inhibition of As2O3-induced apoptosis by chloride channel blocker DIDS in the CNE-2Z cells was analyzed by flow cytometry.RESULTS: As2O3at 5 μmol/L induced apoptosis of CNE-2Z cells in time-dependent manner. The currents with outward rectification were activated when the cells were exposed to 5 μmol/L As2O3. No obvious time- and voltage-dependent inactivation of the currents was observed. The reverse potential of the currents was close to the equilibrium potential for chloride. The activated currents were inhibited by the chloride channel blockers NPPB and DIDS. The 47% hypertonic solution inhibited the activated currents completely. Chloride channel blocker DIDS inhibited the apoptosis of CNE-2Z cells induced by As2O3.CONCLUSION: As2O3activates volume-sensitive chloride channels, and chloride channels may play an important role in the apoptosis of CNE-2Z cells induced by As2O3.

Chloride channels; Arsenic trioxide; Nasopharyngeal carcinoma; Apoptosis

1000- 4718(2017)04- 0647- 08

2016- 11- 22

2016- 12- 16

國家自然科學基金資助項目 (No. 81272223; No. 81273539)；教育部基金項目(No. 20124401110009)；廣東省科技計劃項目(No. 2013B051000059)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 2016A030313495)； 高水平大學建設醫學團組項目(No. 88015306010; No. 88016013041)

R730.23; R329.25

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.012

△通訊作者 王立偉 Tel: 020-85226565; E-mail: twangliwei@jnu.edu.cn； 陳麗新 Tel: 020-85228865; E-mail: tchenlixin@jnu.edu.cn