柔肝顆粒的定性定量方法優(yōu)化研究

陳春鶯，鄒愷平，2，施 敏△

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

·實(shí)驗(yàn)研究·

柔肝顆粒的定性定量方法優(yōu)化研究

陳春鶯1，鄒愷平1，2，施 敏1△

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

目的補(bǔ)充優(yōu)化柔肝顆粒的薄層色譜（TLC）鑒別及含量測(cè)定方法，提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用TLC法對(duì)制劑中赤芍、三七、白術(shù)進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定制劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。結(jié)果 TLC法鑒定專屬性強(qiáng)，陰性無(wú)干擾；毛蕊異黃酮葡萄糖苷的質(zhì)量濃度在0.981～19.62 αg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，r＝0.999 7（n＝6），平均回收率為 99.62%，RSD＝1.69%（n＝6）。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可用于柔肝顆粒的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)。

柔肝顆粒；薄層色譜法；高效液相色譜法；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

柔肝顆粒由黃芪、赤芍、炒白術(shù)、當(dāng)歸、三七等中藥組方，方中以黃芪為君藥，當(dāng)歸、白術(shù)為臣藥，具有補(bǔ)益肝腎、補(bǔ)氣健脾之功效，為南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院消化科根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，以柔肝健脾、益腎活絡(luò)為法擬訂的成方。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪、當(dāng)歸具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用[1]，赤芍、牛膝、三七也對(duì)肝損傷有一定保護(hù)和治療作用[2]。有研究表明，柔肝顆粒具有較好的抗實(shí)驗(yàn)大鼠肝纖維化作用，能減輕肝細(xì)胞損傷，從而有效地保護(hù)肝細(xì)胞[3]。柔肝顆粒為醫(yī)院院內(nèi)制劑，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與新藥要求相去甚遠(yuǎn)。本研究中，按新藥審批的技術(shù)要求，在柔肝顆粒原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了三七、白術(shù)的薄層色譜（TLC）鑒別方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)中赤芍的鑒別進(jìn)行了修訂，增加了方中君藥黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定項(xiàng)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

WD-9413A型凝膠成像分析儀（北京市六一儀器廠）；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器廠）；KQ-1000E型醫(yī)用超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Agilent1260S型高效液相色譜儀，包括G1312C型二元泵，G1316A型柱溫箱，G1315D型DAD檢測(cè)器，Chemstation色譜工作站，G1367E型自動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)Agilent公司)；BP211D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)為111920-201304，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；柔肝顆粒（批號(hào)分別為 1607001，1607002，1608003，江蘇省中醫(yī)院制劑部）；赤芍對(duì)照藥材（批號(hào)為121093-200402）、三七對(duì)照藥材（批號(hào)為 120941-200506）、白術(shù)對(duì)照藥材（120925-200407）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；水為超純水，甲醇為色譜純，其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 赤芍

溶液制備：取柔肝顆粒5 g，研細(xì)，加乙醇10 mL，超聲5 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；同法制備陰性對(duì)照品溶液；取芍藥苷對(duì)照藥材粉末0.5 g，按赤芍供試品溶液同法制備，作為對(duì)照藥材溶液。

薄層色譜鑒別：照薄層色譜法，精密吸取上述3種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1。

圖1 赤芍薄層色譜圖譜

2.1.2 三七

溶液制備：取柔肝顆粒5 g，研細(xì)，加水?dāng)噭颍偌铀柡偷恼〈? mL，振搖，靜置，取上層溶液，加3倍量正丁醇飽和的水，搖勻使分層，取正丁醇層，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；同法制備陰性對(duì)照品溶液；取三七對(duì)照藥材粉末0.5 g，按三七供試品溶液同法制備，作為對(duì)照藥材溶液。

薄層色譜鑒別：照薄層色譜法試驗(yàn)，精密吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-丙酮（5∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品藥材溶液色譜相同位置上顯相同顏色斑點(diǎn)。詳見(jiàn)圖2。

2.1.3 白術(shù)

溶液制備：取柔肝顆粒5 g，研細(xì)，加正己烷15 mL，超聲處理15 min，合并正己烷提取液，揮干，殘?jiān)? mL乙醇溶解，作為供試品溶液；同法制得陰性對(duì)照品溶液；取白術(shù)對(duì)照藥材粉末1g，加正己烷4mL，超聲15min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為對(duì)照藥材溶液。

薄層色譜鑒別：照薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗(yàn)，精密吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，用環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（2∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈365 nm波長(zhǎng)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。詳見(jiàn)圖3。

圖2 三七薄層色譜圖

圖3 白術(shù)薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Hedera ODS-2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.2%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 mL／min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下3種溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜柱的理論板數(shù)以毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000，分離度大于1.5。結(jié)果見(jiàn)圖4。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品9.81 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇適量，溶解，并稀釋至刻度，作為貯備液；精密吸取貯備液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇適量，稀釋至刻度，即得。

圖4 毛蕊異黃酮葡萄糖苷高效液相色譜圖

供試品溶液：稱取樣品約1.0 g，研細(xì)后精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲15 min（功率280 W，頻率53 kHz），加甲醇，稀釋到刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：取黃芪的缺味陰性制劑，依法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液，分別稀釋成質(zhì)量濃度為 0.981，1.962，2.452，4.905，9.810，19.620 μg／mL的溶液，精密吸取不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液各10 μL，測(cè)定峰面積積分值，以質(zhì)量濃度(X，μg／mL)對(duì)峰面積積分值(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝30.199 X-0.183 9，r＝0.999 7 (n＝6)。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度在0.981～19.620 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。詳見(jiàn)表2。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品峰面積的 RSD＝0.40＜5%(n＝6)，表明儀器精密度良好，詳見(jiàn)表3。

重復(fù)性試驗(yàn)：按處方量平行稱取同一批樣品共6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定。結(jié)果樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均含量為4.40 μg／mL，RSD＝0.46%＜5%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。詳見(jiàn)表4。

表2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的線性關(guān)系考察結(jié)果(n＝6)

表3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷日內(nèi)精密度考察結(jié)果（n＝6）

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算峰面積。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的 RSD＝2.19%＜5%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。詳見(jiàn)表5。

加樣回收試驗(yàn)：稱取柔肝顆粒（批號(hào)為1607002）2 g，精密稱定，共6份，置50 mL容量瓶中，精密加入一定量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液，加甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)膜，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取不同批號(hào)柔肝顆粒（批號(hào)分別為 1607001，1607002，1608003），依法制備供試品溶液，每批取3份，依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表7。

3 討論

本研究對(duì)方中多味藥材進(jìn)行了薄層色譜鑒別，由于藥材種類較多，中藥飲片的成分復(fù)雜，不同藥材可能含有相同的化學(xué)成分，僅以化學(xué)成分對(duì)照品為參考，特別是該成分為其非專屬性成分時(shí)，難以作為飲片的定性鑒別依據(jù)。故本研究中建立的TLC鑒別方法使用對(duì)照藥材作為參考，增強(qiáng)了定性鑒別的準(zhǔn)確性與可靠性。

表6 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表7 3批柔肝顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定結(jié)果

本制劑功能柔肝健脾、活血通絡(luò)，用于肝硬化之正氣虧虛、肝脾血瘀證。黃芪為方中君藥，主要含皂苷類、黃酮及其苷類和多糖類成分[4-5]。黃酮類成分有改善血循環(huán)和提高免疫力的作用，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷活性較高，為主要有效成分，有抗病毒、抗菌、調(diào)血脂、抗氧自由基等作用，還有抗缺血和改善血常規(guī)作用[6]。現(xiàn)在多采用HPLC法測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量[6-8]。本研究中所建立的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定方法，經(jīng)方法學(xué)考察表明，其專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可用于柔肝顆粒的質(zhì)量控制。黃芪甲苷作為藥材黃芪的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，其檢測(cè)方法多采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）法，由于樣品處理方法復(fù)雜，含量測(cè)定穩(wěn)定性差，故不作為黃芪含量的測(cè)定方法。

本研究中對(duì)柔肝顆粒原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)赤芍的鑒別進(jìn)行了方法學(xué)研究，建立了三七、白術(shù)的TLC鑒別方法和黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷HPLC含量測(cè)定法。以上3味藥材的薄層色譜定性鑒別，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的定量研究，經(jīng)3批樣品驗(yàn)證考察，方法專屬性強(qiáng)，陰性無(wú)干擾，靈敏度高，重復(fù)性好。通過(guò)定性和定量2種方法的結(jié)合，可更科學(xué)、合理、全面地進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，故可作為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂的可靠依據(jù)。

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Improvement of Qualitative and Quantitative M ethods for Rougan Granules

Chen Chunying1，Zou Kaiping1，2，Shi Min1
（1.Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu，China 210029； 2.Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu，China 210023）

Objective To impove the quality standard of Rougan Granules.M ethods Thin layer chromatography（TLC）method was used to identify Radix Paeoniae Rubra，Notoginseng and Atractylodes in Rougan Granules.The content of calycosin-7-glucoside was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）method.Results The TLC spots were clear with strong specificity and free of interference of negative samples.The linear range of calycosin-7-glucoside was 0.981-19.62 μg／mL，r＝0.999 7（n＝6）.The average recovery rate of calycosin-7-glucoside was 99.62%，RSD＝1.69%（n＝6）.Conclusion The method is accurate，rapid，reliable，and stable with good repeatability，it can be used to control and evaluate the quality standard of Rougan Granules.

Rougan Granules；TLC；HPLC；calycosin-7-glucoside；quality standard

R284.1；R256.4

A

1006-4931(2017)06-0015-05

2016-12-08)

10.3969／j.issn.1006-4931.2017.06.005

陳春鶯，女，主管中藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院制劑質(zhì)量控制，（電話）025-86614204。

△通訊作者：施敏，女，副主任中藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院制劑質(zhì)量控制，（電子信箱）romantic.fieworks＠163.com。