星點設計-響應面分析法優化西芹葉中總黃酮的提取工藝

王志波， 李成思， 張金魁， 林鵬程

(1.青海民族大學藥學院， 西寧810007；2.青海省青藏高原植物資源化學研究重點實驗室， 西寧810007；3.青海省藥物分析重點實驗室， 西寧810007)

星點設計-響應面分析法優化西芹葉中總黃酮的提取工藝

王志波1,2,3， 李成思1,2,3， 張金魁1,2,3， 林鵬程1,2,3

(1.青海民族大學藥學院， 西寧810007；2.青海省青藏高原植物資源化學研究重點實驗室， 西寧810007；3.青海省藥物分析重點實驗室， 西寧810007)

以青海西芹葉為研究對象，通過星點設計-響應面分析法優化西芹葉中總黃酮的提取工藝，并以乙醇體積分數、提取時間、料液比為考察要素，進行三因素五水平星點試驗設計，同時通過方差分析回歸建立數學模型，響應面分析法優化西芹葉中總黃酮的提取工藝。結果顯示，料液比和提取時間對西芹葉的總黃酮提取影響極其顯著，最優提取工藝為提取時間50 min，乙醇體積分數50%，料液比1∶20 (g/mL)。在此條件下，相對誤差為1.24%，與模型預測值相符，總黃酮得率為18.36 mg/g。該工藝合理、快速，為今后西芹葉中總黃酮研究奠定基礎。

西芹葉；星點設計；響應面法；總黃酮

引言

西芹(ApiumgraveolensL.)為傘形花科旱芹屬植物，原產自地中海沿岸，是一種藥食同源蔬菜。西芹營養豐富，其中黃酮類化合物含量很高，具有多種藥理作用和生物活性，對一些常見疾病有很好的治療和預防作用，如抗癌防癌、降低血脂、治療高血壓，及保護心血管和增強機體免疫力等作用[1]。

本文采用的星點設計-響應面分析法，是一種可以將數學和統計方法結合起來的新型實驗方法，其優點是克服正交試驗設計的精密度不足，操作繁瑣的缺陷。同時又能較好的對實驗結果進行預測[2]。并且，查閱文獻得知，近年關于西芹葉中總黃酮的研究還未見報道，因此本文通過星點設計-響應面分析法對西芹葉中總黃酮的提取工藝進行優化，可為藥用西芹葉的質量評價及進一步的研究開發利用提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

西芹葉采于青海省互助縣(經青海民族大學藥學院鑒定為傘形科植物西芹)；蘆丁購于中國藥品生物制品鑒定所；蒸餾水自制；其余所用試劑均為分析純。

1.2儀器

UV-5100B分光光度計(上海重逢科技有限公司)；FA1064N型電子天平(上海精密儀器)；DFY-200C粉碎機(上海谷寧實業有限公司)；KQ-300B型超聲波提取器(昆山市超聲儀器)。

1.3方法

1.3.1待測溶液的制備

取干燥的西芹葉樣品粉末1.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入20 mL 60%乙醇超聲提取30 min，待提取液冷卻后，過濾取其濾液，既得待測溶液。

1.3.2標準曲線的繪制

將精密稱取的3.25 mg蘆丁用70%乙醇定容于25 mL容量瓶中。然后，分別精密吸取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL蘆丁溶液，于25 mL容量瓶中。依據顯色條件依次加入NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液、NaOH溶液，并在510 nm波長處依次測定吸光度[3]，得到回歸方程為：y=27.288，x-0.0269，R2=0.9998，表明線性關系較好。

1.3.3總黃酮含量測定

準確移取1.0mL待測溶液，按照1.3.2的方法進行實驗。最終得出西芹葉總黃酮量的計算公式為[4]：

其中，Y：黃酮提取量(mg/g)；A：吸光度；m：樣品質量(g)。

2結果與分析

2.1單因素試驗

在選定的條件下，即分別固定50%乙醇、提取時間50 min、料液比1∶20 (g/mL)，對乙醇體積分數、提取時間、料液比分別進行考察[5]，結果如圖1所示。

圖1各因素對總黃酮提取率的影響折線圖

依據單因素試驗結果初步選定乙醇體積分數50%，提取時間50 min、料液比1:20 (g/mL)為最佳提取條件[6]，采用星點設計-響應面分析法對其進行優化[7]。

2.2星點設計試驗

2.2.1實驗設計與結果

依據星點實驗設計的方法原理，以提取率為參考指標[8]。用X1，X2，X3表示所設因素，各個因素設五水平，并以1.73、1、0、-1、-1.73表示自變量的水平，表1為各要素水平編碼表，表2為星點實驗設計及結果[9]。

表1因素水平

表2實驗設計與結果

2.2.2模型擬合

以總黃酮提取率為參考指標[10]，用Design Expert軟件分析試驗結果，經擬合回歸，得模型方程[11]：

Y=18.56+0.46X1-0.46X2+0.97X3+0.025X1X2+

該模型方差分析和顯著性檢驗結果見表3。由表3可知，模型的P值小于0.0001，說明模型方差極顯著；各自變量P值<0.05，說明本實驗所考察的各單因素對西芹葉總黃酮提取率影響顯著[12]；綜合分析二次項中X1、X2、X3的響應值，得出試驗所考察的三個因素對總黃酮提取率的影響是一種二次曲線關系，并非簡單的線性關系[13]；方程的失擬項P值0.0733>0.05不顯著，表明其他未知因素的影響可以忽略不計[14]。

表3響應面分析試驗方差分析結果

注：**:差異極顯著，p<0.0001；*:差異顯著，p<0.05。

2.2.3響應面優化和預測

根據回歸方程，利用Design Expert軟件，得出交互作用影響極顯著的3D響應面圖，如圖2、圖3所示。

圖2乙醇體積分數和料液比影響總黃酮提取率的響應面圖

圖3乙醇體積分數和提取時間影響總黃酮提取率的響應面圖

通過圖2、圖3的曲面走勢可知，各自變量對總黃酮的影響都呈現先增大后減小的趨勢[15]。同時依據曲面的陡峭程度得出，乙醇體積分數、提取時間、料液比的交互作用對西芹葉總黃酮提取率的影響極其顯著[16]。故全面分析該回歸模型，最終確定最佳提取工藝為：乙醇體積分數49.65%，料液比1:19.86(g/mL)，提取時間48.4 min，總黃酮提取率18.59(mg/g)。

2.3驗證試驗

為了驗證模型的準確度，以得出的最優工藝為前提條件做6次平行試驗?？傸S酮平均收率為18.36(mg/g)，相對誤差1.24%，與預測值基本一致。

3結束語

文獻檢索表明，西芹葉總黃酮的提取工藝未見使用星點設計-響應面優化法，因此難找到一種確切的函數式來表達各因素和響應值之間的關系，也就無法找到考察各因素在整個區域上的最佳組合，并對響應值的最優值進行預測。

本實驗采用星點設計-響應面優化法，用二次多項式進行擬合，結果顯示，該方法不僅提高了試驗的精確度，還得到了最佳的模型擬合度。同時證實星點設計-響應面優化法得到的最佳工藝參數可靠準確，最終優化得到西芹葉總黃酮的最優提取工藝為乙醇體積分數50%，料液比1∶20(g/mL)，提取時間50 min，總黃酮得率為18.36(mg/g)，為今后西芹葉中總黃酮研究奠定了科學有效的基礎。

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Application of CCD-RSM for Optimization of Total Flavonoids Extraction in Celery Leaves

WANGZhibo1,2,3,LIChengsi1,2,3,ZHANGJinkui1,2,3,LINPengcheng1,2,3

(1.College of Pharmacy, Qinghai Nationalities University, Xining 810007, China; 2.Key Laboratory of Plant Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Chemical Research, Xining 810007, China; 3.Key Laboratory of Pharmaceutical Analysis in Qinghai, Xining 810007, China)

The extraction process of total flavonoids from celery leaves is optimized by CCD-RSM. The effects of ethanol concentration, extraction time, material liquid ratio are taken as the factors of investigation to lead three-factor five-level star-point test design. Simultaneously, the mathematical model is established by regression analysis of variance, and the extraction process of total flavonoids from celery leaves is optimized by the Response Surface Methodology. The results show that material liquid ratio and extraction time have significant effects on the extraction of flavonoids from celery leaves. And the optimum conditions are extraction time of 50 min, 50% ethanol concentration and material liquid ratio of 1∶20 (g/mL). The relative error of validation test is 1.24%, which is coincident with the predicted value. And the total yield of flavonoids was 18.36mg/g. The method is reasonable and rapid, which lays a foundation for the study of total flavonoids in celery leaves.

celery leaves; CCD; RSM; total flavonoids

2017-01-14

青海民族大學創新項目(DCXM-2014-013)

王志波(1991-)，男，山東菏澤人，碩士生，主要從事藥物化學方面的研究，(E-mail)18297004813@163.com; 林鵬程(1966-)，男，青海西寧人,教授，博士，博導，主要從事天然藥用植物資源開發與利用方面的研究，(E-mail)qhlpc@126.com

1673-1549(2017)02-0007-04

10.11863/j.suse.2017.02.02

TB115

A