貴州白山羊L—FABP基因遺傳變異對生長性狀的影響

田應志　崔真華　牟慧蓉　錢成　黃蘭　封竣淇　羅衛星

摘要：本研究旨在探討肝臟型脂肪酸結合蛋白（L-FABP）基因遺傳變異與貴州白山羊生長性狀的關聯性，以期得到能夠影響貴州白山羊各群體生長性狀顯著效應的分子遺傳標記。試驗采用DNA池、PCR-SSCP法結合PCR產物直接測序對貴州白山羊L-FABP 基因4個外顯子進行SNPs篩選，并利用SPSS 180統計軟件分析H-FABP基因遺傳變異與生長性狀間的相關性。多態位點檢測表明，貴州白山羊L-FABP基因內含子兩處存在C4557T和A4575G兩個多態基因座；遺傳效應分析表明，L-FABP基因C4557T和A4575G位點多態座位有利于提高貴州白山羊體重、體高、體斜長和管圍，其中基因型CCGG有利于提高貴州白山羊成年母羊的體高和體斜長；TTGG有利于提高貴州白山羊周歲母羊的體重和管圍。研究結果初步推測L-FABP基因可能影響貴州白山羊部分生長性狀的主效基因或與主效基因連鎖，其多態座位可能作為山羊生長性狀選擇的有效遺傳標記。

關鍵詞：貴州白山羊；L-FABP基因；遺傳變異；生長性狀

中圖分類號：Q751；S827

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2017）02-0006-07國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.002

Abstract：The aim of this study was to explore the correlation between the genetic variation of L-FABP gene and the growth traits of Guizhou white goat in order to obtain molecular genetic markers that could affect the goats growth traits. The SNPs of four different exons of L-FABP genes of Guizhou white goat were screened by DNA pooling and PCR-SSCP combined with PCR product direct sequencing. The correlation between the genetic variation of L-FABP gene and the growth traits was analyzed by SPSS （18.0） software. Examination of the polymorphism loci showed that two SNPs （C4557T and A4575G） were presented in the Intron 2 of L-FABP gene. The effect analysis showed that the polymorphic loci of C4557T and A4575G sites of L-FABP gene can improve body weight， body height， body length and pipe circumference. The genotype CCGG can be in favour of improving body height and body length of adult ewes. The genotype TTGG can be in favour of improving body weight and pipe circumference in aging ewes. The results indicated that L-FABP gene would be a potential major gene or a gene linked to other major genes affecting goat growth traits； its polymorphic loci could be used as effective genetic markers for goat growth traits to guide the molecular breeding of goats.

Key words：Guizhou white goat； L-FABP gene； genetic variation； growth traits

肝臟型脂肪酸結合蛋白（Live fatty acid binding protein， L-FABP）是脂肪酸結合蛋白家族（Fatty acid binding proteins， FABPs）重要組成部分，又稱Z-蛋白，亞鐵血紅素蛋白，是一種與遺傳相關的脂肪酸連接蛋白家族成員，在哺乳動物中，主要表達場所是肝臟組織和小腸，在人的腎臟中也有少量表達[1]。L-FABP基因由4個外顯子和3個內含子組成，有127個氨基酸殘基和2個脂肪酸結合位點，分子量約為144 kDa[2]。L-FABP與FABPs家族成員間氨基酸序列的同源性達3870%，主要由核苷酸鏈的N端附近兩條短的α-螺旋和10條反平行的β-鏈正交的折疊組成，此外L-FABP 還具有一個特殊打開的β-桶型結構的蓋子，β-桶型結構穩定性較強，其空間構型不易發生化學修飾、大分子熒光物質以及基因突變的改變[3]。因L-FABP表達場所主要在肝臟中，所以L-FABP 表達水平的改變可影響脂肪肝、肝硬化以及肝癌的發生發展關系，并有望作為肝損傷早期高敏感檢測指標[4-7]。L-FABP還可通過脂肪酸來調控脂肪的沉積影響動物生長，該基因在畜牧生產領域的研究主要集中在其遺傳變異與豬肉質性能和雞脂肪性狀及組織表達方面[8-10]。

關于L-FABP基因遺傳變異與貴州地方山羊品種的生長性狀的相關研究則鮮見報道，本研究以貴州喀斯特地區獨特的地方優良山羊品種—貴州白山羊為研究對象，采用DNA池、PCR-SSCP法結合PCR產物直接測序檢測L-FABP基因外顯子的多態性，分析其遺傳變異與生長性狀的相關性，為尋找L-FABP基因可能作為影響貴州白山羊生長性狀的分子遺傳標記提供依據。

1材料與方法

11試驗材料

試驗用12～48月齡貴州白山羊成年羊223只（公羊為23只，母羊為200只），均來自貴州白山羊的中心產區—貴州省沿河縣新景鄉，飼養管理、營養水平和免疫程序相同，健康無病。每只試羊頸靜脈采血8mL置于EDTA-K2抗凝真空采血管中，顛倒混勻，置于-20℃保存備用。同時按要求詳實記錄每個個體體重、體高、體斜長、胸圍和管圍5個生長性狀指標數據。

12血液基因組DNA的提取

本試驗采用Ezup 柱式基因組DNA 抽提試劑盒（血液），采購于生工生物工程（上海）股份有限公司，按說明書詳細進行試羊個體基因組DNA的提取。最后經12%的瓊脂糖凝膠檢測，稀釋成終濃度為100～200ng/L，于-20℃冰箱中保存備用。

13引物設計與合成

根據NCBI中GenBank數據庫中山羊L-FABP基因（登錄號為NC_0223031，REGION： 4739238147397985）相關序列，利用NCBI中的 Premier -Blast 和Premier 50軟件針對該基因全部外顯子區設計特異性引物，共設計5對引物（詳見表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

變性劑（98%去離子甲酰胺，25mmol/L EDTA，0025%二甲苯青，0025%溴酚藍），于100℃沸水浴中變性15min，置于-20℃冰箱中保存15min，同時將15%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行250V電壓預電泳30min，待點樣完成先進行250V電壓預電泳30min，后改為120V電壓電泳13～15h，最后銀染顯色判型，挑選不同基因型個體（各3個）的PCR產物送北京諾賽公司和上海英駿生物技術有限公司測序。

15數據處理和統計分析

PCR-SSCP數據分析：統計基因型頻率、等位基因頻率、多態信息含量、有效等位基因數和群體雜合度，并進行卡方適合性檢驗。采用SPSS 180軟件對數據進行統計和關聯分析，建立最小二乘線性模型：Y=μ+G+P+S+G*S + G*P+P*S+e，式中Y為性狀表型值，μ 為群體平均值，G為基因型效應，P為群體效應，S為性別效應，G*S 為基因型和性別互作效應， G*P為基因型和群體互作效應，P*S為群體和性別互作效應，e為殘差效應。結果以均值±標準差表示。

2結果與分析

21PCR產物檢測

用12%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果見圖1，擴增片段整齊、單一無拖尾，大小與預期結果一致，表明引物特異性較好，可直接用于下一步試驗。

22PCR產物與SSCP檢測結果

如圖2所示，在貴州白山羊引物L5的PCR 產物中分別檢測到C4557T和A4575G兩個多態座位，其余引物PCR 產物中未發現多態位點。根據DNA混合池所發現的C4557T位點和A4575G位點（位于內含子2處），設計一對特異性引物，用于下一步進行PCR-SSCP試驗，檢測群體中每個個體突變位點處基因型（圖3所示），在試驗群體中檢測到2類等位基因，分別為C和T 及A和G，共出現6種合并基因型，分別為CCGG、CTGG、CTAG、CCAA、CTAA和TTGG，其中CCGG為A基因型，CTGG為B基因型，CTAG為C基因型，CCAA為D基因型，CTAA為E基因型，TTGG為F基因型，PCR擴增產物測序峰圖詳見圖4。

23L-FABP基因C4557T和A4575G變異位點群體遺傳結構分析

統計分析C4557T和A4575G位點在貴州白山羊公母羊群和全群中的遺傳結構，如表2所示，對于L-FABP基因C4557T位點，三個群體（全群、♀和♂）均以C為優勢等位基因，其等位基因頻率分別為06592、06700和05653，C4557T位點在三個試驗群體中的多態信息含量PIC表現均為中度多態（025005），而公羊群X2檢驗顯示該基因型分布處于Hardy-Weinberg 非平衡狀態（P<005）。

對于L-FABP基因A4575G位點，該位點存在3種基因型，除公羊基因型分布表現為GG>AG>AA外，其余分布表現為AA>GG>AG。母羊群和全群中，A為優勢等位基因，等位基因頻率分別為05269和05400，公羊群中，G為優勢等位基因，等位基因頻率為05870；純合度較為接近，A4575G位點在三個試驗群體中的多態信息含量PIC表現均為中度多態（025005），在公羊群中分布處于Hardy-Weinberg 非平衡狀態（P<005）。

24SNPs位點各效應對生長性狀的影響

根據固定效應模型分析（表3），L-FABP 基因C4557T位點僅在體斜長中不存在性別效應（P>005），其余指標均存在性別效應（P<005），各指標無基因型效應和基因型和群體互作效應（P>005）；A4575G位點在體重和體斜長中無性別效應（P>005），其余指標均存在性別效應（P>005），總體上各指標均不存在基因型和性別與群體互作效應（P>005）。

25L-FABP基因C4557T和A4575G位點多態座位效應分析

L-FABP基因C4557T和A4575G位點多態座位效應分析結果（表4）：該基因多態座位共得到6種不同的基因型，其中成年羊（♂）基因型CCGG、TTGG和周歲羊（♂）TTGG樣本個數為1，相關分析時不予以考慮，而相關分析中無周歲羊（♂）和成年羊（♂）基因型CTAG和CCAA，結果顯示，不同多態座位與貴州白山羊各生長指標間差異顯著或差異極顯著（P<005， 001）。成年羊（♀）基因型CCGG個體的體高和體斜長以及CTAA個體的體斜長極顯著和顯著高于CCAA個體（P<005，001），而CCGG個體體斜長比CTAA個體高；而CCAA個體管圍顯著低于CTAG和CTGG個體；其余指標均差異不顯著且成年羊（♂）各基因型的各個指標均差異不顯著（P>005）。周歲羊（♀） TTGG型個體的體重極顯著高于CCGG個體（P< 001），顯著高于CCAA個體（P<005），而CCGG個體的體高和胸圍顯著低于CTAG個體，其管圍顯著低于CTAA和TTGG，各基因型對體斜長差異不顯著（P>005）。周歲羊（♂）基因型CTGG個體的胸圍和CTAA個體的管圍顯著高于CCGG個體（P<005），其余指標均差異不顯著（P>005）。

3討論與結論

31L-FABP基因多態性檢測及其遺傳結構分析

以貴州白山羊為試驗對象進行DNA池篩選多態位點的文獻已有報導，包括不同基因的多態性與貴州白山羊的生長性狀、肉質性狀和血液免疫指標的關聯性研究[11-15]。本試驗研究在貴州白山羊L-FABP基因共4個外顯子處進行多態性檢測，結果未在L-FABP基因外顯子處篩選出SNPs，而在Intron2處發現C4557T和A4575G兩個多態基因座位；在C4557T和A4575G位點處，試驗群體的有效等位基因數均接近2，表明所對應的等位基因在群體中分布均勻，三個試驗群體位點均處于中度多態。在母羊和全群中分布均符合Hardy-Weinberg平衡，而公羊群中分布則處于Hardy-Weinberg非平衡狀態，這可能是由于公羊群選種和選配不平衡，受遷徙因素的影響較大；也有可能是公羊受到高度選擇的原因，導致公羊群體偏離了Hardy-Weinberg平衡規律。

32L-FABP基因多態性與山羊生長性狀的關聯分析

本試驗發現L-FABP基因的SNP位點在內含子區域，但其不同基因型對貴州白山羊生長性狀仍有關聯，說明該基因較為保守，外顯子區較難出現突變，而內含子序列對基因表達調控的作用也尚未被闡明，但有可能作為調控元件影響基因表達水平。對L-FABP基因進行固定效應模型分析，發現其多態位點均存在群體效應，而除體斜長外，其余指標均存在性別和群體互作效應，可進行下一步相關性分析。對L-FABP基因 C4557T和A4575G位點多態座位效應分析顯示：成年母羊的不同基因型對體高、體斜長和管圍指標均差異極顯著或顯著，而體重是衡量山羊生長發育狀況的重要指標，各基因型對體重和胸圍指標差異不顯著，由此可以推測因各基因型對胸圍指標呈差異不顯著間接影響了體重指標；周歲母羊的各基因型對其體重、體高、胸圍和管圍均差異極顯著或顯著，由此可以驗證上面的推測結果，表明各基因型的體重和胸圍之間存在一定的關聯性。本研究中成年母羊、周歲母羊和公羊的各基因型對管圍均差異顯著，由此可以推測管圍對成年母羊、周歲公羊和母羊的生長有重要影響。

由結果可知，L-FABP基因基因型CCGG有利于提高成年貴州白山羊母羊的體高和體斜長，基因型TTGG為有利于提高周歲貴州白山羊母羊的體重和管圍，該基因型對山羊生長性能具有促進作用，可作為促進山羊生長候選基因型應用于貴州白山羊生長性能輔助選育。

致謝：本研究對相關部門的支持表示衷心的感謝！

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