異丙甲草胺對烤煙根際土壤微生物和酶活性的影響

謝穎　陳媞　龍友華　李榮玉　尹顯慧　李明　吳小毛

摘要：為了探明根際微生物數量與除草劑污染之間的關系，研究了異丙甲草胺對煙草植地根際與非根際土壤微生物的種群動態變化、土壤呼吸強度及酶活性的影響。結果表明：根際土壤中微生物數量、土壤呼吸強度和酶活性均高于非根際土壤。根際土壤微生物對異丙甲草胺的敏感程度依次為真菌〉細菌〉放線菌；除過氧化氫酶外，根際土壤脫氫酶、脲酶及磷酸酶的活性與對照土壤均存在顯著差異。第60 d，異丙甲草胺在根際土壤中的降解率為8050%，半衰期為2682d，比在非根際土壤中的降解速率提高了121倍，半衰期縮短了1776%。

關鍵詞：異丙甲草胺；根際；土壤微生物；呼吸強度；酶活性

中圖分類號：S4828+92

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2017）02-0013-06國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.003

Abstract：In order to investigate the relationship between the herbicide contamination and the number of microorganisms in plant rhizosphere soil， the effect of metolachlor on the microbial number， the intensity of soil respiration and the enzyme activity in tobacco rhizosphere and non-rhizosphere soils were studied. The results showed that the number of rhizosphere microorganisms， the soil respiration intensity and the enzyme activity were higher in rhizosphere soil than non-rhizosphere soil. The sensitivity of microorganisms to metolachlor in rhizosphere soil was in the order of fungi > bacteria> actinomycetes. Except for catalase， there were significant differences between activities of dehydrogenase， urease and phosphatase in the rhizosphere soil and in the non-rhizosphere soil. At 60th day， the degradation rate of metolachlor was 8050% and its half-life was 2682 day in rhizosphere soil. The degradation rates of metolachlor in rhizosphere soil were 121 times of that in non-rhizosphere soil. The degradation half-life of metolachlor in the rhizosphere soil was 1776% shorter than that in the non-rhizosphere soil.

Key words：metolachlor； rhizosphere； soil microorganism； respiration rate； enzymatic activit

根際環境與根際微生物是植物降解有毒有害有機污染物的基礎，農藥等有機污染物影響下的根際土壤與一般土壤在pH、養分組成狀況、微生物組成、酶活性等存在顯著的差別，這些都直接影響一年生單子葉及部分雙子葉雜草的防除時施用的接影響有機污染物在土壤-植物系統中的遷移和轉化行為[1]。

異丙甲草胺作為持效期較長的酰胺類選擇性芽前除草劑，廣泛使用煙草、水稻、大豆田中一年生單子葉及部分雙子葉雜草的防除[2]。目前，已有異丙甲草胺的研究主要有異丙甲草胺對根際土壤微生物數量的影響及其在根際環境中的降解研究、異丙甲草胺對芹菜根際與非根際生物活性的影響、異丙甲草胺及其高效體對我國南方潮土微生物的影響、異丙甲草胺防除煙地雜草效果評價等，但未見異丙甲草胺對煙地根際微生物及土壤酶活性的影響的相關報道[3-6]。為此從異丙甲草胺對土壤微生物種群動態變化及土壤呼吸作用，土壤根際與非根際酶活性以及其殘留等方面探討異丙甲草胺對土壤環境質量的影響提供科學依據。

1材料與方法

11供試藥品

異丙甲草胺標準品（≥988%）購自美國迪馬科技有限公司；72%異丙甲草胺乳油購自江西日上化工有限公司；乙腈（色譜純）；純凈水（用前過045μm水系濾膜過濾）購自杭州娃哈哈集團。試驗中其他藥品和試劑均為分析純。

12供試土壤

土壤采自貴州花溪烤煙種植試驗地中，以烤煙K326煙株為中心15cm半徑范圍鏟出整個土塊，抖落大塊土壤后的煙株根系連同與之緊密黏附的土壤置于保鮮袋帶回實驗室，仔細刷下并收集黏附于煙株根系的土壤，風干，過1mm篩，作為煙株根際土壤。

13試驗方法

分別稱取500g花溪植煙土壤于1000mL 燒杯中，加入1mL含異丙甲草胺的甲醇溶液，使其濃度分別為1、3、6、9、12mg/kg，待甲醇揮發后攪拌均勻，用無菌蒸餾水調節土壤濕度為田間最大持水量的60%，每個處理均設置3次重復，同時設空白對照。土樣于25℃培養箱中恒溫黑暗培養1、3、7、14、21、30、45和60d后取樣測定真菌、細菌和放線菌數量、過氧化氫酶、脫氫酶、脲酶和磷酸酶的活性、土壤呼吸強度，及異丙甲草胺殘留量。在整個試驗階段，適時補水保持土壤含水量不變。

14分析方法

土壤微生物計數采用固體平板梯度稀釋涂布培養計數法，細菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基培養，放線菌用改良高氏1號培養基培養，真菌用查彼克氏培養基培養；土壤呼吸強度采用直接吸收法（密閉法）滴定測定[7]；過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定；脲酶活性采用靛酚藍比色法測定；由于供試土壤pH為632，故按中性磷酸酶測定方法測定土壤磷酸酶活性；脫氫酶采用三苯基四氮唑氯化物（TTC）比色法測定[8]。以上試驗均采用室內模擬方法，設4個對照，每個對照設3次重復，其中1個處理設為空白對照，取三次重復的平均值。

2結果與分析

21異丙甲草胺影響下根際土壤微生物區系的動態變化

異丙甲草胺影響下根際土壤細菌數量的變化如圖1所示。由圖可知，在整個試驗期內，根際土細菌數量均高于非根際土；經異丙甲草胺處理根際與非根際土壤，細菌的生長開始被抑制，然后被促進。在試驗前期（1～7d），與對照土壤相比，施用異丙甲草胺處理后，根際與非根際土壤細菌的生長均受到抑制，在第1d時抑制作用達到最大值。隨后，各處理的抑制作用逐漸減弱，異丙甲草胺在第14d時對根際土壤細菌生長的抑制效應消失，開始促進細菌生長，且促進效應一直繼續到試驗結束，并且細菌數量均顯著高于對照土壤（p<005）。經異丙甲草胺處理根際土壤的細菌數量在21d到達最大值，其中處理根際土壤細菌數量比對照根際土壤的增加了2407%，而非根際土壤細菌數量比對照土壤的降低了993%。此時，處理根際土壤細菌數量是處理非根際土壤的109倍，即處理土壤的根際效應R/S（每克根際土壤中所含的微生物數與非根際土壤的相應值之比）為101，而對照土壤的根際效應R/S為106，差異均達到顯著水平（p<005）。

從圖2可以看出，異丙甲草胺對根際與非根際土壤真菌的生長一直表現為促進作用，30～60d內，真菌數量均顯著高于對照土壤。異丙甲草胺處理土壤真菌數量在14d時均到達最大值，其中根際土壤真菌數量比對照土壤增加了3098%，相應的非根際土壤真菌數量比對照土壤增加了2600%，此時處理土壤的根際效應R/S也達到峰值為112，對照土壤的根際效應R/S為108，差異達到顯著水平（p<005）。在整個試驗周期內，無論是處理土壤還是對照土壤，根際土中的真菌數量均要高于非根際土，但在試驗后期（45～60d），根際與非根際土壤的真菌數量之間不存在顯著差異。

異丙甲草胺毒害下根際土壤放線菌數量的變化見圖3。在培養期間，根際土壤放線菌數量均高于非根際土壤；異丙甲草胺對放線菌生長的影響為抑制-恢復-刺激。處理后1～14d，與對照土壤相比，異丙甲草胺處理下的放線菌生長受到抑制，1d時抑制作用最大，根際土壤的最大抑制率為1460%，非根際土壤的抑制率為1441%。異丙甲草胺處理土壤根際土壤的放線菌數量在14d時達到峰值，此時，處理土壤的根際效應R/S也達到最大值為107，差異也達顯著水平（p<005）。14d后抑制作用逐漸減弱，異丙甲草胺處理的根際土壤放線菌數量在21d時恢復到對照水平，30d時開始促進放線菌生長，且促進作用一直繼續到試驗結束，但差異不顯著。在整個試驗周期內，無論是處理土壤還是對照土壤，根際土中的放線菌數量均要高于非根際土。

22異丙甲草胺影響下根際土壤呼吸的動態變化

異丙甲草胺對根際土壤呼吸的影響如圖4所示。由此可知，與非根際土相似，施用異丙甲草胺對根際土壤呼吸均有一定的刺激作用，在3d時，土壤呼吸強度達到了最高值，異丙甲草胺處理的根際土壤呼吸強度比對照土壤和對照非根際土增加了1994%，相應的非根際土壤呼吸強度比對照土壤的增加了1589%，處理根際比處理非根際土增加了1595%，即處理土壤的根際效應R/S為116，對照土壤的根際效應R/S為112，差異均達到顯著水平（p<005）。隨后異丙甲草胺對根際土壤呼吸的刺激作用逐漸減弱。經異丙甲草胺處理根際土壤的呼吸在7～60d內繼續保持刺激狀態，而非根際土壤的呼吸強度在45d時基本與對照持平。在整個試驗周期內，根際土壤呼吸強度均高于非根際土壤。

23異丙甲草胺影響下根際土壤酶活性的動態響應

施用異丙甲草胺后，根際與非根際土壤過氧化氫酶活性的響應如圖5所示。在整個試驗期內，各處理根際土壤的過氧化氫酶活性均高于對照土壤；異丙甲草胺處理根際土壤的過氧化氫酶活性呈現激活-恢復的變化趨勢。在試驗前期（1～14d），各處理對土壤過氧化氫酶活性均有一定的激活作用，激活作用均在1d時最為強烈，異丙甲草胺處理后，根際土壤過氧化氫酶活性比對照土增加了3024%，相應的非根際土壤酶活性僅增加2064%，處理土壤的根際效應R/S為115，而對照土壤的根際效應R/S為105。顯著性分析表明，各處理的激活作用逐漸減弱，至第21d時，激活效應消失，均表現為抑制作用，異丙甲草胺處理非根際土壤的酶活性在21d時也顯著低于對照土壤，30d左右異丙甲草胺對根際與非根際土壤酶活性的抑制作用消失，過氧化氫酶受到第二次激活，且激活效應一直繼續到試驗結束，但酶活性與對照土壤不存在顯著差異（p<005）。

圖6可以看出，在試驗的各個時期，無論是對照土樣，還是處理土樣，根際土的脫氫酶活性均比同期的非根際土壤酶活性要高。與非根際土相似，在整個培養期間，經異丙甲草胺處理后，根際土壤脫氫酶活性的變化為激活-抑制-恢復-激活。在試驗初期（1～3d），除草劑對土壤脫氫酶活性均有一定的激活作用，激活作用和根際效應在3d時達到峰值，施用異丙甲草胺的根際土壤脫氫酶活性為對照土壤的10973%，相應的非根際土壤酶活性為對照土壤的10437%，處理土壤和對照土壤的根際效應R/S為113，差異均達顯著水平（p<005）。3d后，各處理對脫氫酶的刺激作用逐漸降低，異丙甲草胺處理根際與非根際土壤的酶活性均在7d時恢復至對照水平，在14d時被顯著抑制（p<005），30d時酶活性恢復至正常水平，45d時脫氫酶受到第二次激活，且酶活性顯著高于對照土壤，并一直繼續至試驗結束。

異丙甲草胺對根際與非根際土壤脲酶活性的影響見圖7。經異丙甲草胺處理后，根際土壤脲酶活性的變化如圖7所示，與非根際土壤相似，在整個試驗期間，異丙甲草胺對土壤脲酶活性的影響呈現先抑制、后恢復、再激活的變化動態。異丙甲草胺對根際土壤脲酶活性的抑制作用在7d時達到最大值，處理根際土壤脲酶活性比對照土壤降低了684%，相應的處理非根際土壤酶活性比對照土壤的降低了651%，此時異丙甲草胺處理土壤根際效應R/S也達到峰值為109，且相應對照的根際效應與R/S為108，均存在顯著差異（p<005）。7d后異丙甲草胺對土壤酶活性的抑制作用逐漸降低，21d時均恢復至對照水平，并在45d時高于對照土壤。在整個試驗期內，無論是處理土壤還是對照土壤，根際土樣脲酶活性均要高于非根際土樣。

異丙甲草胺影響下根際土壤磷酸酶活性的變化見圖8。從圖可以看出，培養期間，根際土磷酸酶活性均高于同期的非根際土。在試驗前期（1～21d），與非根際土壤相似，除草劑處理下的根際土壤磷酸酶均受到抑制，7d時，抑制效應達到峰值，異丙甲草胺處理根際土壤的磷酸酶活性為對照土壤的8477%，相應的非根際土壤酶活性為對照土壤的8362%，而處理根際土壤酶活性為處理非根際土壤的11284%，即處理土壤的根際效應R/S為113，而對照土壤的根際效應R/S為111，存在顯著差異（p<005）。14d后異丙甲草胺對根際土壤磷酸酶的抑制作用逐漸減弱，在30d時恢復至對照水平，異丙甲草胺處理土壤的酶活性于45d后高于對照土壤，60d時差異均達顯著水平（p<005）。

24異丙甲草胺在根際土壤中的降解動態

異丙甲草胺在根際土壤與非根際土壤中的降解動態如圖9所示。試驗初期（1～3d），異丙甲草胺在土壤中的降解不明顯，有一個延遲期，可能是因為土壤中微生物對外來污染物有一個馴化或適應過程。第7d開始，異丙甲草胺降解速度加快，尤其是在根際土壤中，在第60d，根際土壤中異丙甲草胺的降解率為8050%，而在非根際土壤中的降解率僅為7383%，差異均達到顯著水平（p<005）。異丙甲草胺在根際土壤中的降解也可用一級反應動力學方程模擬（表1），根際土壤中異丙甲草胺的降解速率常數為00259，相應的半衰期為2682d；非根際土壤中異丙甲草胺的降解速率常數為00213，其半衰期為325d。與非根際土壤相比，根際土壤中異丙甲草胺的降解速率提高了121倍，半衰期縮短了1776%。

3結論

（1）在整個試驗周期內，異丙甲草胺影響下根際土壤中三大類群微生物的數量均高于非根際土壤微生物，這與異丙甲草胺對根際土壤微生物數量的影響及其在根際環境中的降解研究結果相符。真菌對異丙甲草胺最為敏感，細菌次之，放線菌則具有一定的抗性。培養期間，經處理后的土壤的細菌和放線菌的生長呈現出抑制、恢復或激活的變化動態。

（2）施用異丙甲草胺對根際土壤呼吸均有一定的刺激作用，在3d時，土壤呼吸強度達到了最高值，隨后異丙甲草胺對根際土壤呼吸的刺激作用逐漸減弱，在隨后的7～60d繼續保持刺激狀態，而非根際土壤的呼吸強度在45d時基本與對照持平。在整個試驗周期內，根際土壤呼吸強度均高于非根際土壤。這與異丙甲草胺及其高效體對潮土微生物的影響結果相近[9]。

（3）本研究表明，無論是處理土壤還是對照土壤，根際土樣中四種酶的活性均要高于非根際土壤。異丙甲草胺對土壤過氧化氫酶和磷酸酶活性的影響表現為激活-抑制-恢復的變化動態，且對過氧化氫酶激活或抑制程度與濃度成正比。對脫氫酶活性的影響呈現為激活-抑制-恢復-激活，這與試驗發現68mg/kg和68mg/kg的Rac-異丙甲草胺及S-異丙甲草胺對脫氫酶活性的影響為先激活、后抑制、再激活的研究結果相近[10]；土壤脲酶活性變化則呈現“抑制-激活-恢復-抑制”趨勢，這與丁草胺對脲酶活性的影響大致相符[11]。

（4）研究表明，從第7 d開始，異丙甲草胺降解速度在根際土壤中高于非根際土壤中，第60d，根際土壤中異丙甲草胺的降解率為8050%，而在非根際土壤中的降解率僅為7383%，差異均達到顯著水平（p<005）。根際有機污染物消解加快與根際區微生物數量及活性改變關系密切[12-14]。

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