不同消毒劑對雞舍空氣大腸桿菌的殺菌效果觀察

摘要：為了提高雞舍環(huán)境的消毒效果，降低雞大腸桿菌病的感染率，提高雞場的經(jīng)濟(jì)效益本實(shí)驗(yàn)對河北不同雞舍空氣中的大腸桿菌進(jìn)行采樣。應(yīng)用玻板凝集試驗(yàn)鑒定41株大腸桿菌菌株的O抗原血清型。采用周德慶介紹的濾紙片法測定雞舍空氣大腸桿菌對84消毒劑、新歐福、過氧乙酸、聚維酮碘、氨酚五類消毒劑的敏感性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雞舍空氣大腸桿菌分別屬于O₂、O₅、O₆₅、O₇₈、O₁₀₁、和O₁₁₉，這五種血清型，O₆₅為分離菌株的優(yōu)勢血清型，占分離菌株的31.71%，占定型菌株的43.33%。雞舍空氣大腸桿菌對不同消毒劑敏感性差異較大。對過氧乙酸的敏感性最高，聚維酮碘與氨酚次之，新歐福及84合劑的敏感性相對較低。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；消毒劑；血清型；耐藥性

中圖分類號：S851.36 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：2096-3637（2017）03-0001-04

1文獻(xiàn)綜述

我國養(yǎng)雞業(yè)集約化程度的提高，對雞場環(huán)境污染的防控工作日益成為實(shí)現(xiàn)養(yǎng)雞業(yè)良性循環(huán)、提高養(yǎng)殖效益和實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。而微生物的侵入是造成畜禽舍污染的一個重要原因。雞的多種傳染病為氣源性傳染病，病原微生物借助于空氣或以空氣為媒介傳播。畜禽舍內(nèi)致病微生物的傳播、擴(kuò)散成為影響畜禽健康狀況的主要原因，并且畜禽的環(huán)境情況與蛋雞飼養(yǎng)人員的健康有直接的關(guān)系，因此對畜禽舍中的環(huán)境微生物研究是很重要的。

根據(jù)前人們的這些研究，我們可以得出雞舍環(huán)境存在污染，并且大腸桿菌對環(huán)境的污染也不容小覷。屈鳳琴等對雞舍空氣中致病微生物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：雞舍空氣中葡萄球菌、大腸桿菌的污染程度比較嚴(yán)重，但沙門氏菌和霉菌的污染程度較小。韓梅英等對雞舍空氣中的大腸桿菌的污染情況進(jìn)行研究，結(jié)果表明：測定出的6棟雞舍的空氣受大腸桿菌的污染。Wang Jin等對規(guī)模化雞舍空氣中細(xì)菌含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示：肉雞飼養(yǎng)中期雞舍內(nèi)空氣中細(xì)菌含量比飼養(yǎng)前期和飼養(yǎng)后期高，而風(fēng)速與細(xì)菌含量呈反比，并且使用消毒劑帶雞消毒可以明顯降低雞舍內(nèi)空氣中細(xì)菌含量。石玉祥等對規(guī)模化雞舍空氣污染情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)11棟雞舍中有7棟雞舍受金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌污染，檢出陽性率分別為63.6%、27.27%。

環(huán)境中的微生物存在的必然性不可視而不見，因此環(huán)境消毒是規(guī)模化雞舍控制疾病流行的重要環(huán)節(jié)。許多研究人員對雞舍消毒劑的應(yīng)用研究進(jìn)行探討，蔡會全對抗毒威（二氯異氧尿酸鈉）、過氧乙酸、新潔爾滅（苯扎溴銨）及作者配制的“噴霧靈（5%聚維酮碘溶液）”4種消毒劑在雞舍溫為31℃，相對濕度80%的條件下，用30ml/m³，進(jìn)行噴霧帶雞消毒，用自然沉降法測定消毒前后空氣中細(xì)菌和霉菌含量，計算殺滅率。結(jié)果表明：噴霧后10～30min抗毒威、過氧乙酸、新潔而滅、噴霧靈對細(xì)菌殺滅率依次是82.1%、82.9%、90.2%、95.0%，噴霧靈對雞舍中細(xì)菌的殺滅效果最佳，至少可維持2小時。趙家喜等對過氧乙酸和百毒殺（癸甲溴銨）帶雞消毒效果進(jìn)行觀察，試驗(yàn)結(jié)果表明帶雞消毒可明顯提高肉種雞存活率，但是對其生長發(fā)育并無顯著影響。張紅見等對3種消毒劑百毒殺（癸甲溴銨）、來蘇爾（甲酚）、二氧化氯對3棟雞舍的消毒效果進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示：百毒殺消毒效果最好，其次是來蘇爾，二氧化氯復(fù)合消毒劑消毒效果最差。黃炎困等對雞舍內(nèi)使用5%過氧乙酸噴霧消毒后的消毒效果進(jìn)行研究，結(jié)果表明：使用5%的過氧乙酸能夠明顯降低雞舍內(nèi)細(xì)菌總數(shù)，并且顯示出空氣質(zhì)量越差的雞舍使用5%過氧乙酸消毒后消毒效果越明顯的特點(diǎn)。張順合等研究了固體高氧化電位消毒劑對禽舍空氣質(zhì)量的影響，結(jié)果顯示：使用固體高氧化電位消毒劑的雞舍空氣中的細(xì)菌總數(shù)顯著性地少于對照組，噴霧消毒效果可以維持6h，因此使用檢科Ⅰ號消毒劑進(jìn)行帶雞消毒可顯著性改善雞舍內(nèi)的空氣質(zhì)量。

本研究主要是研究河北省規(guī)模化雞舍空氣中不同血清型的大腸桿菌對消毒劑耐藥現(xiàn)狀，以闡述河北省規(guī)模化雞舍空氣中不同血清型的大腸桿菌優(yōu)勢血清型與消毒劑耐藥性間的關(guān)系，同時為雞源大腸桿菌病的防治和改善規(guī)模化雞舍空氣質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。以此擬解決的關(guān)鍵問題是確定分離雞舍空氣大腸桿菌菌株的優(yōu)勢血清型及對消毒劑耐藥性，并測定其對5種常用消毒劑的敏感性，分析優(yōu)勢血清型與耐藥性的關(guān)系。

2實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1材料

2.1.1培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基杭州濱和微生物試劑有限公司批號150228

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基杭州濱和微生物試劑有限公司批號141125

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基杭州濱和微生物試劑有限公司批號150113

伊紅美蘭培養(yǎng)基杭州濱和微生物試劑有限公司批號141229

水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂）杭州濱和微生物試劑有限公司批號150104

LB肉湯培養(yǎng)基杭州濱和微生物試劑有限公司批號150326

2.1.2藥敏片

常用藥敏試紙杭州天和微生物試劑有限公司

2.1.3生化反應(yīng)管

細(xì)菌微量生化反應(yīng)管杭州濱和微生物試劑有限公司

2.1.4實(shí)驗(yàn)消毒劑

均為市售消毒劑。

84合劑山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司規(guī)格：有效氯含量為50g/L 7.5g/L

新歐福瑞普（天津）生物藥業(yè)有限公司規(guī)格：500ml，戊二醛25g+癸甲溴銨25g

過氧乙酸廣州粵豐動物保健有限公司規(guī)格：16.0%～23.0%（g/ml）

聚維酮碘河北地邦動物保健科技有限公司規(guī)格：有效碘0.5%

氨酚江蘇三儀勝意藥業(yè)有限公司規(guī)格：酚41%～49%醋酸22%～26%

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1雞舍空氣大腸桿菌采樣

我們利用TYK-6型六級篩孔撞擊式空氣微生物采樣器在邯鄲、唐山、衡水、邢臺、石家莊地區(qū)不同養(yǎng)殖模式的蛋雞舍進(jìn)行空氣采樣。

采樣方法：在雞舍四角及中央各設(shè)一個采樣點(diǎn)，將制備的麥康凱平板培養(yǎng)基按順序逐個放入采樣器的圓盤中，用三個彈簧掛鉤把六級圓盤緊密地連接在一起。將六級撞擊器放在高1.5m的支架上，連接主機(jī)，開始采樣，每次采樣5min即可。采樣結(jié)束，打開撞擊器，取出采樣平皿，蓋上平皿蓋，用封口膜封住，37℃培養(yǎng)24h備用。整個過程中平皿的放入與取出，動作一定要快，以避免雜菌污染平皿。注意順序和編好號碼，切勿弄錯。

2.2.2細(xì)菌分離純化培養(yǎng)

經(jīng)培養(yǎng)24h后將麥康凱平板培養(yǎng)基從恒溫箱取出，挑取疑似菌進(jìn)行鏡檢，然后將疑似大腸桿菌接種到伊紅美蘭培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h；然后再鏡檢，直到得到純培養(yǎng)物，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3生化試驗(yàn)

將純化的分離菌，接種到斜面培養(yǎng)基中，于37℃恒溫箱培養(yǎng)24～48h，然后接種于葡萄糖、甘露醇、尿素酶、枸櫞酸鹽、MR試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)等微量生化反應(yīng)管，按倪語星等報道常規(guī)方法進(jìn)行生化指標(biāo)測定。

2.2.4血清學(xué)試驗(yàn)

2.2.4.1單因子血清的配制

將大腸桿菌埃希氏菌單因子血清溶于0.5%石炭酸生理鹽水5ml，裝入小瓶中，蓋緊，備用。

2.2.4.2抗原的制備

將被檢菌株劃線接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)24h。在伊紅美蘭培養(yǎng)基上挑取光滑、圓整的黑色帶金屬光澤的菌落1～2個接種至斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h。挑取培養(yǎng)物劃線接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，均勻涂布于平皿內(nèi)，置37℃培養(yǎng)24h。

用0.5%石炭酸生理鹽水2ml洗下營養(yǎng)瓊脂平皿上的培養(yǎng)物，倒入5ml的圓底試管中，制成濃稠細(xì)菌懸液，在121℃高壓鍋中高壓2h，破壞其“K”抗原，制成高壓“O”抗原。

2.2.4.3玻板凝集試驗(yàn)

取小圓底試管的高壓抗原與大腸埃希氏菌單因子血清進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)。即高壓抗原和血清各取一鉑金耳置玻板上混勻，0.5min至1min中出現(xiàn)明顯凝集者為“陽性反應(yīng)”。同時以高壓抗原與0.5%石炭酸生理鹽水混合物做對照，觀察有無自凝集現(xiàn)象。

2.2.4.4結(jié)果判定

“#”——液體完全透明，管底覆蓋明顯傘狀凝集沉淀物

“+++”——液體略呈渾濁，管底傘狀凝集沉淀物明顯。

“++”——液體呈中等程度渾濁，管底有中等量散裝凝集沉淀物。

“+”——液體不透明或透明度不明顯，有不太明顯的傘狀凝集沉淀物。

“-”——液體混濁，無任何凝集沉淀物，細(xì)菌可能沉于管底，呈光滑圓盤狀，振蕩時呈均勻混濁。

最終結(jié)果判定：以“++”作為被檢抗原的效價中點(diǎn)。

2.2.5消毒劑對雞舍空氣大腸桿菌的殺菌效果測定

按周德慶（2006）介紹的濾紙片法測定大腸桿菌對消毒劑的敏感性，根據(jù)敏感圈直徑的大小來判定敏感性的標(biāo)準(zhǔn)，20mm以上判為極敏；15～20mm判為高敏；10～14mm判為低敏；10mm以下判為耐藥，即為不敏感。操作方法：將濾紙制成同藥敏片大小的紙片，裝進(jìn)小瓶中121℃高壓。把純培養(yǎng)物接種到肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h。用滅菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌鑷子夾取濾紙片浸入消毒劑中，之后貼在營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24h。觀察抑菌圈的大小，分析結(jié)果。

3結(jié)果與分析

3.1雞舍采集細(xì)菌的培養(yǎng)

將采樣的麥康凱平板培養(yǎng)24h后出現(xiàn)不同的菌落。大腸桿菌在麥康凱瓊脂上形成紅色的菌落，然后挑取紅色大小均勻的菌落涂片鏡檢，進(jìn)行初步鑒定，然后將疑似菌落接種到伊紅美蘭培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，24h。大腸桿菌在伊紅美蘭培養(yǎng)基上產(chǎn)生黑色帶金屬閃光的菌落。挑取黑色帶金屬光澤的單個菌落接種到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行24h純培養(yǎng)，備用。

3.2大腸桿菌生化鑒定

分離的41株大腸桿菌的生化鑒定結(jié)果符合大腸埃希菌的特征，見表2。

3.3大腸桿菌血清型測定

通過玻板凝集試驗(yàn)，對41種大腸桿菌進(jìn)行0血清型鑒定。從表3中可以看出30株大腸桿菌確定了血清型，分別為O₂、O₅、O₆₅、O₇₈、O₁₀₁和O₁₁₉，還有11株未定型。

鑒定出30株雞源大腸桿菌6種0血清型，占分離菌株的73.17%；未定型的11株占分離菌株的26.83%。065為分離菌株的優(yōu)勢血清型，占分離菌株的31.71%，占定型菌株的43.33%；其次為O₁₀₁O₂，分別占定型菌株的23.33%和16.67%。見表4。

23a～23y標(biāo)號的大腸桿菌是在雞舍健康狀態(tài)下采取的。而14a～14q標(biāo)號的大腸桿菌是在雞舍爆發(fā)大腸桿菌病的情況下采取的。其血清型比較見表5。

3.4消毒劑對大腸桿菌殺菌效果觀察

消毒劑不同，對大腸桿菌的抑菌效果也會有所差異。通過試驗(yàn)，得出以下結(jié)果，見圖1與圖2。

由圖我們可以看出，新歐福、過氧乙酸、聚維酮碘、氨酚都可用于日常衛(wèi)生消毒，84也可以只是效果較于其他幾種，效果不顯著。

當(dāng)雞舍爆發(fā)疾病時，消毒劑選擇非常重要。由圖我們可以看出過氧乙酸作用效果最好，氨酚效果次之，聚維酮碘再次之。

3.5不同血清型對消毒劑的敏感性觀察

雞舍的良好空氣環(huán)境有助于提高雞各方面的機(jī)能，尤其是自身的免疫機(jī)能。同時降低疾病的爆發(fā)率，提高經(jīng)濟(jì)效益。所以，正確的選擇有效的消毒劑是雞舍環(huán)境保護(hù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。規(guī)模化雞場應(yīng)提高此方面的意識，把風(fēng)險降到最低，創(chuàng)造可觀的經(jīng)濟(jì)效益。