墨蘭新品種‘夢之蘭’種子無菌萌發研究

【摘要】本研究以福建省林業科技試驗中心選育的墨蘭新品種‘夢之蘭’為試驗材料，對其種子進行非共生萌發研究，篩選合適的培養基，建立完整的無菌播種萌發技術體系。本研究得出‘夢之蘭’種子無菌萌發最佳誘導培養基為：改良MS+6-BA1.5mg·L-1 +NAA0.8mg·L-1；最佳增殖培養基為：改良MS+6-BA1.5mg·L-1+ KT1.5mg·L-1+ NAA0.4mg·L-1；最佳生根培養基為：1/2MS+NAA1.0mg·L-1+IBA1.5mg·L-1+KT1.5mg·L-1。

【關鍵詞】蘭花；雜交育種；萌發；組織培養

abstract ：This study takes Meng Zhilan（a new variety of the Cymbidium）， which is chosen and nurtured by forestry science and technology experiment center in Fujian province ， as the experimental material for research on the vitro seed germination without fungus， screening of appropriate culture medium and the establishment of a complete system of aseptic seeding germination technology.This study concluded that the superiorinduction mediumfor aseptic germination of seeds was improved MS+6-BA1.5mg·L-1 +NAA0.8mg·L-1.The best suitable differentiation medium for aseptic germination of seeds was improved MS+6-BA1.5mg·L-1+ KT1.5mg·L-1+ NAA0.4mg·L-1while the best rooting medium for that was 1/2MS+NAA1.0mg·L-1+IBA1.5mg·L-1+KT1.5mg·L-1.

Key Words： orchid； pollination； germination； tissue culture

‘夢之蘭’（Cymbidum sinense ‘Mengzhilan’）是2014年12月經福建省林木品種委員會審定通過的墨蘭新品種（良種編號：閩R-SC-CS-038-2014）。該品種區別于普通的墨蘭品種，其葉片線藝具鵝黃色邊沿，花瓣竹葉型外三瓣為金黃色，開花性好，有微香，具有較廣闊的市場前景。為加速新品種的擴繁，本研究對其種子進行非共生萌發研究，以期篩選合適的培養基，建立完整的‘夢之蘭’無菌播種萌發技術體系。

1 材料與方法

1.1試驗材料

本研究選取福建省林業科技試驗中心選育的墨蘭新品種‘夢之蘭’果莢（蒴果）為外植體試驗材料。

1.2試驗方法

1.2.1外植體消毒處理

選取健康植株上飽滿、表面無裂痕、無病害斑點的成熟果莢。先將果莢表面用清水清洗干凈，然后用毛筆刷蘸少量洗衣粉，輕輕刷洗果莢表面。刷洗時應避免用力過猛損傷表面，

刷洗完成后，清水沖洗30min，然后置于超凈臺，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%Hgcl2消毒10min，無菌水沖洗5次，吸干水分后，將蒴果縱切為二， 用鑷子輕輕夾取著生于側膜胎座上的種子，均勻鋪在培養基上。種子無菌萌發采用的培養基有 MS、 改良MS、KC三種。播種后置于培養室中暗培養， 培養溫度為25℃，30d后陸續觀察種子萌發情況并記錄種子萌發過程中的形態變化。

1.2.2誘導培養基篩選

以MS、改良MS、KC為基本培養基，添加不同的激素（6-BA、NAA），采用4因素3水平（見表1）的正交設計L9（34），共9個處理，每處理10瓶，重復3次，調查統計原球莖平均萌芽數、平均萌發率，再通過方差分析進行顯著性檢驗，最終篩選出最佳的培養基配方。

1.2.3增殖培養基篩選

以MS、改良MS、KC、B5為基本培養基，添加不同的激素（6-BA、KT、NAA），采用5因素4水平（見表2）的正交設計的L16（45），共16個處理，每處理10瓶，重復3次，調查統計其平均增殖倍數，再通過方差分析進行顯著性檢驗。

1.2.4生根培養基篩選

以1/2MS固體培養基為基本培養基，添加不同的生長調節劑（NAA、IBA、KT），采用4因素3水平（見表3）的正交設計L9（34），共9個處理，把雜交果莢無菌播種后的繼代小苗（苗高1.0～2.0cm）接種于不同處理的培養基上，每處理3瓶，每瓶接10株小苗，重復3次，調查統計每瓶平均生根數、平均生根率，分析比較不同配方組合處理的生根效果，以篩選出最佳的生根培養基配方。

1.2.5培養條件

在果莢無菌播種后誘導階段一直進行暗培養，直至分化出原球莖后轉入繼代增殖培養基中，繼代增殖培養與生根培養試驗時，外植體接種后，均進行7d暗光培養處理，之后將其置于光照時間為12h·d-1、溫度（25+3）℃、光照強度1500Lux～2000Lux的條件下培養。誘導（初代）培養、繼代培養糖用量為30g·L-1，生根培養糖用量為20g·L-1，瓊脂粉7g·L-1。

1.2.6數據統計與分析

采用 Excel 2007 分析數據，用 SPSS17.0統計軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1不同培養基和激素配比對原球莖萌發的影響

由表4結果分析可以看出，3個因素對其原球莖數和萌發率影響的主次關系為：B（6-BA）>A（培養基）>C（NAA），最優組合為A1B3C3。

由表5方差分析可知，基本培養基對‘夢之蘭’原球莖和萌發率的影響顯著、6-BA對原球莖的影響極顯著而對萌發率影響顯著、NAA對‘夢之蘭’原球莖、萌發率的影響不顯著。

不同培養基組合，其誘導原球莖數不同，高濃度6-BA與NAA的培養基上容易產生原球莖，平均原球莖數隨著6-BA和NAA的濃度的升高而增加；適當的NAA濃度，不但萌發的原球莖增多，而且顏色鮮綠、分化效果好。其原球莖數和萌發率均最高的為處理3，平均原球莖數為91個，平均萌發率為89%；其次是處理6，其不定芽數為75個，萌發率為74.4%。綜合以上分析，誘導不定芽分化培養基以處理3為最佳。因此，‘夢之蘭’種子無菌誘導原球莖萌發的最佳培養基為：改良MS+6-BA1.5mg·L-1 +NAA0.8mg·L-1，能獲得分化能力較強的原球莖。

2.2增殖培養基的篩選

本研究中，將誘導培養基中萌發的原球莖轉接到增殖培養基上進行培養，表6為40d后統計增殖的原球莖數，由表6結果數據可看出，平均增殖倍數以處理3最高，達6.1；其次為處理4和處理8，平均增殖倍數為5.4；最差的為處理13，平均增殖倍數數2。

由表6結果分析可看出，4個因素對其增殖倍數影響的主次關系為：A→B→D→C，即基本培養基對其增殖倍數影響力（A）>6-BA對其增殖倍數的影響力（B）>NAA對增殖倍數的影響力（D）>KT對增殖倍數的影響力（C）。

由表7方差分析可知，因素A（基本培養基）對增殖倍數影響極顯著，因素B（6-BA）、因素C（KT）和因素D（NAA）對增殖倍數的影響顯著。說明，不同水平的基本培養基、6-BA、KT、NAA對增殖倍數有不同的影響。因素A（基本培養基）的1水平、因素B（6-BA）、因素C（KT）和因素D（NAA）的3水平對原球莖的增殖效果最好，即最佳的增殖培養基為：改良MS+6-BA1.5mg·L-1+ KT1.5mg·L-1+ NAA0.4mg·L-1。

2.3生根培養基的篩選

采用1/2MS分別附加NAA（0.5、1.0、1.5）、IBA（1.0、1.5、2.0）和KT（0.5、1.0、1.5）進行生根培養，選取無根苗轉入生根培養基中培養。30天后調查統計生根情況，結果見表8。結果表明：各處理都能誘導‘夢之蘭’小苗生根，但生根率有顯著差異（表9）。培養基中添加低濃度的NAA和IBA，并附低濃度的AC的試驗處理其誘導生根的效果均好于不加生長素或加入較高濃度生長素的試驗處理，說明低濃度的生長素較易誘導‘夢之蘭’小苗生根，而高濃度的生長素對‘夢之蘭’小苗生根有抑制作用。從表8可看出，處理5的平均生根條數為3.6條，其平均生根率最高為89.6%。因此，處理5，即1/2MS+NAA1.0mg·L-1+IBA1.5mg·L-1+KT0.5mg·L-1為‘夢之蘭’組培苗最佳的生根培養基。

3 結論

‘夢之蘭’種子無菌誘導原球莖的最佳培養基為：改良MS+6-BA1.5mg·L-1 +NAA0.8mg·L-1，能獲得分化能力較強的原球莖，平均萌發率為89%。

增殖培養中，改良MS+6-BA1.5mg·L-1+ KT1.5mg·L-1+ NAA0.4mg·L-1最佳的增殖培養基配方，增殖倍數約達6.1。

生根培養中，以1/2MS+NAA1.0mg·L-1+IBA1.5mg·L-1+KT1.5mg·L-1為最佳的生根培養基配方，生根效果最好，生根率最高，達89.6%。

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作者簡介：李秀娟（1984年—），女，碩士研究生，研究方向：植物分子育種。