茄子SSR多態性標記篩選及雜交種純度鑒定

摘要：【目的】建立一套快速、準確、高效的茄子雜交種純度鑒定方法，為其制種過程中除偽存真及大面積推廣應用提供技術支持。【方法】挑選已公布的48對SSR引物對2個茄子雜交種15-16和1-7的親本進行多態性標記篩選，選取有效引物對茄子雜交種進行純度鑒定，并結合田間植株純度鑒定，驗證SSR分子標記純度鑒定的有效性。【結果】在48對SSR引物中，有12對引物在雜交種15-16親本材料中存在多態性，其多態性引物帶型呈互補帶型的有8對（SM14、SM15、SM17、SM20、SM29、SM30、SM34和SM45）；有5對引物在雜交種1-7親本材料中存在多態性，其多態性引物帶型呈互補帶型的有4對（SM15、SM20、SM24和SM29）。分別選取2對呈互補帶型的SSR引物進行雜交種純度鑒定，結果顯示雜交種15-16和1-7的純度分別為99%和100%，與田間種植鑒定結果一致。【結論】采用SSR分子標記檢測茄子雜交種純度具有準確、高效的特點，可為茄子雜交制種過程中真假雜種鑒定提供技術支持。

關鍵詞： 茄子；雜交種；純度鑒定；SSR分子標記

中圖分類號： S641.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）07-1148-07

0 引言

【研究意義】茄子（Solanum melongena L.）屬茄科（Solanaceae）茄屬（Solanum）一年生草本植物，是世界上重要的蔬菜作物之一（Gramazio et al.，2016），原產于亞洲熱帶地區，在我國各地均有種植。生產上，利用茄子雜種優勢的增產、穩產效果顯著。目前，茄子雜交制種主要采用人工授粉的方法，加上生物混雜和機械混雜等因素干擾，獲得的雜交種種子質量無法保證，因此要保證茄子雜交種質量，就必須對其進行純度鑒定（張敏等，2013），即雜交育種過程中的種子純度鑒定是保證作物產量和品種質量的關鍵。【前人研究進展】現階段茄子種子純度鑒定主要依靠田間種植方法，不僅周期較長，鑒定成本高，還易受環境因素和人為因素影響（李懷志等，2011；潛宗偉等，2014）。如何準確、高效地鑒定茄子種子純度已成為育種生產亟待解決的首要問題。隨著分子標記技術的發展，DNA分子標記已涉及到各研究領域，尤其在農作物種子純度鑒定方面呈現出替代傳統田間種植鑒定的趨勢（李進波等，2005；王同華等，2012；劉國棟等，2013；陰云伙等，2015）。SSR簡單重復序列又稱為微衛星DNA，廣泛分布于基因組的不同位置，其高度多態性主要來源于串聯數目的不同，根據兩端序列的高度保守性可設計引物對進行PCR擴增，以揭示其多態性。SSR分子標記具有分布數量豐富、多態性高、共顯遺傳、擴增穩定和易檢測等優點，目前已成功應用于多種農作物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、重要性狀標記及相關基因克隆等領域（李根英等，2006；常瑋等，2009；陸徐忠等，2014；李淑斌等，2015；倪先林等，2015；葉春秀等，2015；Kumar et al.，2016；孫萍等，2017）。在茄子雜交種鑒定方面，王利英等（2012）從236對SSR分子標記篩選出15個多態性標記，對3個茄子品種進行鑒定，結果表明，應用SSR分子標記進行茄子品種純度鑒定與田間檢測結果一致；潛宗偉等（2014）從152對SSR引物中篩選出2對有效引物，并利用這2對引物對京茄218雜交種進行純度鑒定，結果證實，與傳統田間鑒定相比，SSR分子標記是一種更準確、簡單、高效的茄子種子純度鑒定方法。【本研究切入點】不同雜交種鑒別所需SSR分子標記也不同，且茄子雜交種從制種到大面積生產播種周期較長，傳統田間種植鑒定耗時費工，因此急需建立一套快速、準確、高效且適合當地特定茄子品種的雜交種純度鑒定方法。【擬解決的關鍵問題】以茄子雜交品種15-16和1-7及其親本為供試材料，篩選出特異性強、穩定性好的SSR分子標記引物，旨在建立一套快速、準確、高效的茄子雜交種純度鑒定方法，為其制種過程中除偽存真及大面積推廣應用提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

茄子15-16和1-7均為雜交種，其親本為武漢市農業科學技術研究院蔬菜科學研究所選育獲得的高代自交系。雜交種15-16（紫茄）表現為長條形，早中熟，耐熱性較強，果萼片、果面呈黑紫色，果長約35.0 cm，果徑約3.5 cm，適宜在長江流域及以南地區露地栽培。雜交種1-7（綠茄）表現為粗棒形，耐低溫能力強，果萼片呈亮綠、果面呈黑紫色，果長約32.0 cm，果徑約6.0 cm，適合保護地越冬栽培。雜交種及其親本材料采用穴盤法育苗，在幼苗出現3～4片真葉時定植溫室大棚，雜交種群體按順序進行編號。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 茄子基因組DNA提取 茄子基因組DNA提取參考沈進娟等（2016）的方法，采集幼葉進行基因組DNA提取，純合親本各取10株混樣提取基因組DNA，雜交種分單株對應編號分別提取100株基因組DNA。提取方法：剪去幼苗嫩葉置于研缽中，加入800 μL 2×CTAB提取液（含1% β-巰基乙醇）進行研磨，勻漿后轉移至1.5 mL離心管中；加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），混勻，室溫下12000 r/min離心10 min，取上清液重復抽提1次；上清液用等體積的異丙醇在-20 ℃下沉淀1 h，然后4 ℃下12000 r/min離心10 min，沉淀用75%乙醇洗滌2次，晾干后，加入適量含RNase A的雙蒸水溶解，DNA存儲管編號和田間編號順序一致。

1. 2. 2 SSR擴增反應及電泳檢測 參考Nunome等（2003a，2003b）開發的茄子SSR分子標記引物，挑選其中48對引物由武漢擎科生物技術有限公司合成。SSR-PCR反應體系12.0 μL，包含6.0 μL PCR Mix（2×），3.0 μL ddH2O，1.0 μL模板DNA（50 ng/μL），正、反方向引物各1.0 μL（2.5 μmol/L）。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行30個循環；72 ℃延伸5 min；12 ℃終止反應。退火溫度統一設定為56 ℃。擴增產物加入2.0 μL 6×DNA變性Buffer，95 ℃變性5 min后立即冰上預冷，再以6%變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳進行檢測（45 W，80 min）。PAGE凝膠經0.5%硝酸銀染色后，以2%氫氧化鈉和0.5%甲醛顯色。

1. 2. 3 多態性引物篩選 將備用的48對SSR引物用于4個親本的特異帶譜篩選，篩選出條帶清晰、多態性較好的共顯性標記，用于后續雜交種純度鑒定。

1. 2. 4 種子純度鑒定 分別挑選2對多態性好的共顯性標記引物用于2個雜交種群體純度鑒定，觀察雜種是否為親本雜合帶型，對PAGE凝膠結果進行拍照記錄。

1. 2. 5 田間種植純度鑒定 雜交種15-16和1-7分別按行株距45 cm×40 cm進行種植，各種植100株，依次進行編號，觀察統計各植株的農藝性狀。根據父、母本與雜交種的葉色、株型、花色和果型等進行田間純度鑒定，并與SSR分子標記鑒定結果進行對比，以驗證SSR分子標記純度鑒定的有效性。

2 結果與分析

2. 1 多態性引物篩選結果

利用48對SSR引物在雜交種15-16和1-7親本材料中進行初篩及重復性驗證，最終確定有14對多態性引物（圖1），多態性引物比例為29.17%。其中，12對SSR引物在雜交種15-16親本材料中存在多態性，5對SSR引物在雜交種1-7親本中存在多態性，特異性SSR引物信息詳見表1。在雜交種15-16中，多態性引物帶型偏親本一方的引物有4對（SM2、SM4、SM42和SM47），呈互補帶型的有8對（SM14、SM15、SM17、SM20、SM29、SM30、SM34和SM45）；在雜交種1-7中，多態性引物帶型偏親本一方的引物有1對（SM41），呈互補帶型的有4對（SM15、SM20、SM24和SM29）。值得注意的是，引物對SM20和SM29能分別擴增出3種不同帶型（母本帶型、父本帶型和其他帶型），引物對SM4能擴增出兩套親本的差異帶型，因此這3對引物可用于鑒別其他雜株的混入。

2. 2 茄子雜交種種子純度鑒定結果

選取多態性引物SM17和SM30對茄子雜交種15-16單株材料進行純度鑒定，另取多態性引物SM15和SM29對雜交種1-7單株材料進行純度鑒定，結果顯示，引物SM17和SM30鑒定出茄子雜交種15-16的純度均為99%，對應雜交種編號為70號，相應編號在兩對引物對中均表現為母本帶型（圖2和圖3），說明70號單株很有可能為母本混雜，無父本和其他雜交種混入。引物SM15和SM29鑒定出茄子雜交種1-7的純度為100%（圖4和圖5），無父母本和其他雜交種混雜。

通過對比分析發現，在雜交種15-16和1-7兩個群體中所選取SSR引物對100株雜交種的純度鑒定結果非常準確。在雜交種15-16群體中，70號單株在兩對SSR引物上均呈母本帶型，其他單株則表現為父母親本雜合帶型；在雜交種1-7群體中，所有單株在兩對SSR引物上均表現為父母親本雜合帶型。說明這些SSR引物均可用于茄子雜交種15-16和1-7的純度鑒定。

2. 3 田間種植鑒定結果

于始花期根據茄子株形、花色和萼片顏色等對兩個雜交種群體進行田間表現調查，結果發現兩個雜交種群體的群內長勢較一致。在雜交種15-16的100株群體中，70號單株與32號對照單株（CK）明顯不同，其株系較矮、葉色較淺（圖6），但與母本表型基本相似，確定其群體純度為99%。在雜交種1-7的100株群體中，所有單株表型均表現一致，未發現親本或其他雜交種污染。即田間種植調查結果與SSR分子標記純度鑒定結果一致。

3 討論

茄子存在遠緣雜交不親和，因此其商業品種幾乎全部來自栽培茄自交系配組（莊勇和王述彬，2007）。茄子栽培種親緣關系較近，要找到親本間多態性呈共顯性表達的SSR分子標記通常比較困難。此外，不同茄子品種間的多態性標記也各不相同，需重新篩選適合的多態性分子標記。SSR分子標記具有穩定性強、共顯性高等優點，非常適合應用于種子純度鑒定，目前該技術已在水稻、玉米、小麥、大豆和番茄等農作物中得到廣泛應用（李根英等，2006；常瑋等，2009；陸徐忠等，2014；王鳳格等，2014；趙海艷等，2015）。SSR分子標記在茄子中的應用雖已有報道，但篩選出的多態性引物相對較少，且尚未形成統一的檢測標準。

本研究采用SSR分子標記對2個茄子雜交種15-16和1-7的親本材料進行SSR引物多態性篩選，結果表明，針對雜交種15-16的有效（互補型）引物有8對（SM14、SM15、SM17、SM20、SM29、SM30、SM34和SM45），針對雜交種1-7的有效（互補型）引物有4對（SM15、SM20、SM24和SM29）。選取引物對SM17和SM30用于雜交種15-16的種子純度鑒定，發現兩對引物鑒定的雜交種純度均為99%，且混雜單株的編號與田間種植鑒定的植株編號一致，說明這兩對引物可用于雜交種15-16群體材料種子純度的SSR分子標記鑒定。該套茄子雜交種群體存在的母本污染可能是由于母本去雄不徹底或人為操作誤差所致。此外，選取引物對SM15和SM29用于雜交種1-7的種子純度鑒定，結果發現所檢測材料的帶型圖譜均呈父母親本雜合帶型，判定其純度為100%，與田間種植鑒定結果吻合，說明此套材料生產制種較嚴格，同時證實這兩對引物可用于雜交種1-7群體材料種子純度的SSR分子標記鑒定。綜上所述，采用SSR分子標記檢測茄子雜交種種子純度具有準確、高效的特點，可為茄子雜交制種中真假雜種鑒定提供技術支持。

4 結論

采用SSR分子標記檢測茄子雜交種純度具有準確、高效的特點，可為茄子雜交制種過程中真假雜種鑒定提供技術支持。

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（責任編輯 蘭宗寶）