第一、二代轉(zhuǎn)cp4—epsp基因大豆鑒定方法的建立

摘要：【目的】建立一種廣譜性鑒定第一、二代轉(zhuǎn)cp4-epsp基因大豆的檢測(cè)方法，為準(zhǔn)確鑒定第一、二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆及其產(chǎn)品提供技術(shù)支持。【方法】根據(jù)第一、二代轉(zhuǎn)基因大豆的cp4-epsp基因保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)能同時(shí)鑒定兩代轉(zhuǎn)基因大豆外源基因cp4-epsps的引物和探針，建立一種廣譜性鑒定第一、二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆的方法，并從準(zhǔn)確性、特異性、靈敏性及重復(fù)性4個(gè)方面對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)估。【結(jié)果】設(shè)計(jì)的引物/探針對(duì)鑒定第一、二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆及其產(chǎn)品具有廣譜性；建立的檢測(cè)方法能檢測(cè)到反應(yīng)體系中低至5×100拷貝的cp4-epsps基因，Ct為38.88，且能同時(shí)檢測(cè)出兩代轉(zhuǎn)基因大豆。準(zhǔn)確性和特異性評(píng)估結(jié)果顯示僅兩代轉(zhuǎn)cp4-epsp基因的大豆能被檢測(cè)到；40次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，反應(yīng)體系中5×100拷貝的cp4-epsps基因片段的檢出率為100%。【結(jié)論】建立的第一、二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆鑒定方法具有特異強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，可用于轉(zhuǎn)cp4-epsp基因大豆及其產(chǎn)品的監(jiān)測(cè)。

關(guān)鍵詞： 轉(zhuǎn)基因大豆；cp4-epsps基因；廣譜性；特異性；靈敏度

中圖分類號(hào)： S565.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）07-1155-06

0 引言

【研究意義】cp4-epsps是土壤農(nóng)桿菌（Agrobacterium sp.）CP4株系的一段編碼5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的基因序列，由于其編碼的EPSPS較植物體內(nèi)的EPSPS對(duì)草甘膦除草劑更具耐受性（王關(guān)林和方宏筠，2005），因此cp4-epsps基因被轉(zhuǎn)入植物中以增強(qiáng)植物對(duì)草甘膦除草劑的抵抗力。自2004年起，我國(guó)已批準(zhǔn)進(jìn)口用作加工原材料的轉(zhuǎn)基因大豆有12種，其中MON87769和305423是改良品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因大豆，MON87701是抗蟲大豆，其余9種轉(zhuǎn)基因大豆是抗除草劑大豆（王國(guó)英，2001；蘭青闊等，2008；汪琳等，2011；朱琳峰等，2015）。在抗除草劑大豆中，第一代轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2和第二代轉(zhuǎn)基因大豆MON89788是進(jìn)口量較大的兩個(gè)品種，均被轉(zhuǎn)入cp4-epsps抗除草劑基因，為了同時(shí)準(zhǔn)確鑒定兩代轉(zhuǎn)基因大豆，建立一種廣譜性鑒定第一、二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆的檢測(cè)方法，對(duì)保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】蘭青闊等（2008）、汪琳等（2011）、肖笑（2012）及朱琳峰等（2015）均根據(jù)第一代轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2中的cp4-epsps基因序列（GenBank登錄號(hào)AB209952和I43998）建立了轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法，但其僅能鑒定第一代轉(zhuǎn)基因大豆。早期，我國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中也有一些針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆中cp4-epsps基因的檢測(cè)方法，如GB/T 19495.4-2004、GB/T 19495.5-2004、GB/T 19495.6-2004等（中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，2004a，2004b，2004c），但這些方法無(wú)法明確指出檢測(cè)對(duì)象是第一代還是第二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆，且很難準(zhǔn)確檢測(cè)到第二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆中的cp4-epsps基因。我國(guó)農(nóng)業(yè)部基于End Point PCR原理設(shè)計(jì)了能同時(shí)檢測(cè)第一、二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆中cp4-epsps基因的簡(jiǎn)并引物（農(nóng)業(yè)部1861號(hào)公告-5-2012），但與Real Time PCR相比，該方法還需進(jìn)一步通過(guò)測(cè)序或Southern Blotting驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，檢測(cè)過(guò)程相對(duì)繁瑣。【本研究切入點(diǎn)】采用上述方法很難準(zhǔn)確快捷鑒定出以第二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆為原材料加工生產(chǎn)的食品，存在漏檢第二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆及其產(chǎn)品的可能，目前能同時(shí)鑒定兩代轉(zhuǎn)基因大豆的方法鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】建立了一種基于Real Time PCR原理能同時(shí)準(zhǔn)確鑒定含第一、二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆及其產(chǎn)品的廣譜性方法，為精準(zhǔn)鑒定轉(zhuǎn)基因大豆食品提供技術(shù)支持，以保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆GTS40-3-2和MON89788粉末及用于驗(yàn)證方法特異性的其他轉(zhuǎn)基因作物粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)自歐盟聯(lián)合研究中心測(cè)量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究所（IRRM）。主要試劑：植物基因組DNA純化試劑和探針型（TaqMan水解探針）Real Time PCR Master Mix均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。主要儀器設(shè)備：超微量分光光度計(jì)（Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific Corporation，USA）和實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)（Real Time PCR System 7500， Applied Biosystem Corporation， USA）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 DNA分離與純化 分別稱取轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆GTS40-3-2和MON89788粉末、含量為3%的GTS40-3-2大豆粉末及其他非轉(zhuǎn)基因粉末樣品各100 mg。參照植物基因組DNA純化試劑盒說(shuō)明分離、純化各樣品中的基因組DNA。

1. 2. 2 引物和探針設(shè)計(jì) 為了驗(yàn)證是否成功提取大豆DNA，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19495.4-2004中的引物/探針序列，擴(kuò)增大豆內(nèi)標(biāo)基因Lectin；用生物信息學(xué)方法BLAST比對(duì)GenBank中大豆GTS40-3-2的cp4-epsps基因序列（SEQ1，GenBank登錄號(hào)I43998）和大豆MON89788的cp4-epsps基因序列（SEQ2，GenBank登錄號(hào)GV597339），查找cp4-epsps基因的保守序列。根據(jù)保守序列，采用Primer Express設(shè)計(jì)能同時(shí)準(zhǔn)確擴(kuò)增大豆GTS40-3-2和MON89788 cp4-epsps基因的引物和探針（表1）。擴(kuò)增cp4-epsps基因探針標(biāo)記的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分別是6-羧基熒光素（FAM）和6-羧基四甲基羅丹明（TAMRA）。

1. 2. 3 Real Time PCR擴(kuò)增 將各樣品的基因組DNA溶液稀釋至25 ng/μL。反應(yīng)體系（25.0 μL）：DNA稀釋液3.0 μL，2×Taq Man Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至25.0 μL。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)重復(fù)。把配制好的反應(yīng)體系置于7500型熒光定量PCR儀器上，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。

1. 2. 4 檢測(cè)方法評(píng)估 用設(shè)計(jì)的引物和探針擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米（TC1507、NK603、MON863、MON810和3272）粉末混合樣品、轉(zhuǎn)基因大豆（GTS40-3-2和MON89788）、非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因甜菜種子粉末混合樣品，以確定檢測(cè)方法的特異性。

將分離、純化得到含量為3%的大豆GTS40-3-2樣品DNA溶液稀釋成50 ng/μL，然后再按照1∶10比例梯度稀釋至5×100、5×10-1和5×10-2 ng/μL。根據(jù)大豆基因組大小（1.115×109 bp）（Arumuganathan and Earle，1991），計(jì)算出含量為3%的GTS40-3-2大豆粉末樣品DNA濃度為5×101、5×100、5×10-1和5×10-2 ng/μL的溶液分別對(duì)應(yīng)含cp4-epsps基因1×103、1×102、1×101和1×100拷貝/μL。分別在反應(yīng)體系中加入5.0 μL上述4個(gè)濃度的DNA溶液作為模板，使反應(yīng)體系中cp4-epsps基因含量分別含5×103、5×102、5×101和5×100拷貝，實(shí)時(shí)擴(kuò)增cp4-epsps基因以測(cè)定檢測(cè)方法的靈敏度（鑒定下限）。對(duì)初步獲得的靈敏度進(jìn)行40次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定靈敏度的置信概率，同時(shí)驗(yàn)證檢測(cè)方法的重復(fù)性。

此外，將含量為3%的GTS40-3-2大豆粉末樣品和其他非轉(zhuǎn)基因樣品在相同的反應(yīng)條件下用該方法進(jìn)行分析鑒定，用已知含量為3%的GTS40-3-2大豆粉末樣品的鑒定結(jié)果作為該方法的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 引物和探針設(shè)計(jì)

將大豆GTS40-3-2的cp4-epsps基因序列（SEQ1）與大豆MON89788的cp4-epsps基因序列（SEQ2）用DNAMAN v6.0進(jìn)行比對(duì)分析，找到了333 bp的相對(duì)保守序列（圖1），且二者的同源性僅為81%。采用Primer Express v3.0對(duì)SEQ1與SEQ2的333 bp保守序列進(jìn)行搜尋，找到了一對(duì)用軟件評(píng)估罰分（Penalty）最小的引物/探針。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為68 bp。

2. 2 轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆的擴(kuò)增結(jié)果

用設(shè)計(jì)的引物/探針擴(kuò)增大豆GTS40-3-2和MON89788，結(jié)果（圖2）顯示，第一、二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆中的cp4-epsps基因均被擴(kuò)增，擴(kuò)增圖譜呈S形曲線。由此可見(jiàn)，本研究設(shè)計(jì)的引物/探針能實(shí)時(shí)鑒定兩代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆，該引物/探針對(duì)鑒定第一、二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆具有廣譜性。

2. 3 檢測(cè)方法的評(píng)估結(jié)果

特異性評(píng)估結(jié)果（圖3）顯示，建立的檢測(cè)方法除了能準(zhǔn)確鑒定轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2和MON89788外，無(wú)法鑒定其他樣品。靈敏度評(píng)估結(jié)果（圖4）顯示，建立的檢測(cè)方法能檢測(cè)到反應(yīng)體系中低至5×100拷貝的cp4-epsps基因，Ct為38.88（表2）。為了排除偶然因素，對(duì)5×100拷貝的cp4-epsps基因進(jìn)行40次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果（圖4）表明，反應(yīng)體系中5×100拷貝的cp4-epsps基因片段檢出率為100%，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的Ct分布在36.97～ 39.11，平均值為38.01。因此，建立的檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，且具有較好的重復(fù)性。此外，從待測(cè)盲樣中，含量為3%的GTS-40-3-2大豆被鑒定出（Ct為25.47），表明建立的檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高。

3 討論

轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)是近20年顛覆性科學(xué)技術(shù)之一（焦悅等，2016），許多優(yōu)良品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品在各領(lǐng)域被商業(yè)化應(yīng)用，如通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物反應(yīng)器生產(chǎn)醫(yī)用抗生素，利用各種生物工程細(xì)菌生產(chǎn)疫苗，種植抗蟲、抗病毒、抗環(huán)境脅迫等轉(zhuǎn)基因作物以應(yīng)對(duì)來(lái)自蟲害、病害、不利環(huán)境的影響（慈曉燕，2004；馬玉婷，2008；Wang et al.，2011；張磊，2011；賀明艷，2015）。由于轉(zhuǎn)基因生物是基因重組技術(shù)獲得，不是天然存在，因此轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的安全性一直備受懷疑（常超和伍金娥，2007；Ruane and Sonnino，2011；Aleksejeva et al.，2014）。轉(zhuǎn)基因食品的食用安全性也一直是公眾關(guān)注的焦點(diǎn)（王國(guó)英，2001；玄立杰和謝英杰，2010；王磊和李曉蘭，2014）。我國(guó)從2001年開(kāi)始集中出臺(tái)了一系列轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的法律和規(guī)章制度，對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的研發(fā)、進(jìn)口、流通和應(yīng)用等環(huán)節(jié)進(jìn)行了具體規(guī)定。技術(shù)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品是保障這些法律和規(guī)章制度得以徹底貫徹和實(shí)施的重要前提和必要手段。

本研究發(fā)現(xiàn)，雖然第一代轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2和第二代轉(zhuǎn)基因大豆MON89788均被轉(zhuǎn)入cp4-epsps抗除草劑基因，但二者的cp4-epsps基因序列只有81%的同源性，可能是為了增強(qiáng)表達(dá)蛋白質(zhì)的抗除草劑能力，導(dǎo)致第二代轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的cp4-epsps基因部分堿基發(fā)生了修飾改變，因此原方法無(wú)法準(zhǔn)確鑒定第二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆。本研究針對(duì)上述問(wèn)題設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物和探針，建立了一種廣譜性鑒定轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆及其產(chǎn)品的Real Time PCR檢測(cè)方法。一種新建的鑒定方法，需從特異性、準(zhǔn)確性、靈敏性及重復(fù)性等角度進(jìn)行評(píng)價(jià)。引物和探針的高特異性是PCR的首要前提（宋君等，2014）。本研究設(shè)計(jì)的引物/探針和優(yōu)化的反應(yīng)體系可鑒定10種轉(zhuǎn)基因樣品，僅含cp4-epsps基因的大豆GTS40-3-2和MON89788 2個(gè)樣品能檢測(cè)到積累的熒光信號(hào)，表明本研究建立的方法對(duì)兩代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆具有高度特異性，在實(shí)際應(yīng)用中不會(huì)因方法的非特異性導(dǎo)致假陽(yáng)性鑒定結(jié)果。評(píng)估一種鑒定方法的準(zhǔn)確性，一般采用已知的樣品作為盲樣進(jìn)行鑒定。盲樣的鑒定結(jié)果是反映方法準(zhǔn)確性的主要指標(biāo)，本研究建立的方法能準(zhǔn)確鑒定混在其他樣品中含量為3%的GTS40-3-2大豆盲樣，表明該方法準(zhǔn)確性高。靈敏性是表征方法的鑒定能力，即能準(zhǔn)確鑒定被鑒定對(duì)象的最小量。因此，靈敏度是考察一種鑒定方法的重要指標(biāo)。理論上，利用PCR可檢測(cè)到1拷貝的DNA分子，但在分析實(shí)踐中，常因DNA等大分子溶液的均一性低于離子化合物溶液的均一性及微量液體轉(zhuǎn)移等問(wèn)題檢測(cè)不到1拷貝的DNA片段（宋君等，2014）。本研究經(jīng)過(guò)40次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均能檢測(cè)到僅有5×100拷貝的cp4-epsps基因片段，充分表明建立的檢測(cè)方法具有高度靈敏性，達(dá)到歐盟轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)方法的不高于5×100拷貝的靈敏度要求（Scholtens et al.，2010）。由于在評(píng)估方法的靈敏度研究中重復(fù)了40次試驗(yàn)，因此本研究未專門設(shè)置方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。40次5×100拷貝的cp4-epsps基因重復(fù)被鑒定出，充分說(shuō)明該檢測(cè)方法的重復(fù)性較好。

4 結(jié)論

建立的第一、二代轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆鑒定方法具有特異強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，可用于轉(zhuǎn)cp4-epsps基因大豆及其產(chǎn)品的監(jiān)測(cè)。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）