貴州辣椒脈斑駁病毒的檢測及株系分化研究

摘要：【目的】明確貴州辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）的分布和遺傳進化情況，為該病毒的基因功能及其與宿主植物互作關(guān)系研究提供科學依據(jù)?！痉椒ā坎捎梅崔D(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）對采自貴州貴陽、遵義、黔西和大方的疑似ChiVMV辣椒樣品進行擴增并測序；運用DNAMAN和MEGA對ChiVMV CP基因和和3'-UTR進行序列拼接及分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹?！窘Y(jié)果】從39份疑似ChiVMV辣椒樣品中檢測出7份陽性樣品，檢出率為17.95%。將貴州ChiVMV株系的部分CP基因和3'-UTR序列在NCBI中進行核苷酸序列比對，發(fā)現(xiàn)其與來源于四川辣椒上的ChiVMV株系的同源性最高，為99%，與我國其他省份ChiVMV株系同源性大于90%；構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明貴州株系與四川和云南株系親緣關(guān)系最近?！窘Y(jié)論】貴州ChiVMV株系存在明顯的株系分化現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞： 辣椒；辣椒脈斑駁病毒；株系分化；貴州

中圖分類號： S432.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）07-1220-05

0 引言

【研究意義】辣椒是貴州的主要經(jīng)濟作物之一，常年栽培面積33.33萬ha左右，約占我國辣椒總栽培面積的20%。近年來，隨著辣椒種植面積的逐漸擴大，病毒病對辣椒的危害日益嚴重（王莉爽等，2015）。目前侵染辣椒的病毒不少于45種，其中辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）（Green and Kim，1991）已成為嚴重侵染并危害辣椒的主要病毒之一。ChiVMV是一種（+）ssRNA病毒，屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），主要危害茄科植物。該病毒在辣椒上引起葉脈暗綠條紋，葉沿皺縮，葉片變小，畸形，在幼嫩葉片上的癥狀尤為明顯；嚴重時發(fā)生落花現(xiàn)象，產(chǎn)生雜色畸形果，影響辣椒的品質(zhì)和產(chǎn)量，給椒農(nóng)帶來嚴重經(jīng)濟損失。ChiVMV主要依靠蚜蟲以非持久性傳播，也能通過病株汁液和機械接觸等方式傳播，但不能通過種子傳播；人工接種可侵染莧色藜（Wang et al.，2007）。ChiVMV傳播擴散速度較快，近年來在辣椒、番茄和煙草上相繼被發(fā)現(xiàn)，其危害范圍逐漸擴大，且已報道的ChiVMV株系在國內(nèi)具有遺傳分化趨勢。不同株系的鑒定和遺傳分化研究是開展ChiVMV寄主范圍、癥狀類型、蚜傳效率、致病性等研究的前提。因此，明確貴州辣椒ChiVMV的發(fā)生、分布和變異情況，對該病毒的基因組功能及其與寄主植物的相互作用機制研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內(nèi)外對馬鈴薯Y病毒屬許多成員的基因組結(jié)構(gòu)和基因產(chǎn)物功能、病毒的株系分化和遺傳變異等已有深入研究，但針對ChiVMV的研究較少。Ong等（1979）在馬來西亞首次報道了ChiVMV在辣椒上存在，隨后在韓國、泰國、印度及我國臺灣等地區(qū)也相繼發(fā)現(xiàn)和報道了該病毒（Tsai et al.，2008）。龔殿等（2011）采用分子克隆方法首次在我國報道了ChiVMV海南文昌分離物基因組序列，確定了ChiVMV-WC在生物進化史上的地位。賈樹丹等（2012）采用馬鈴薯Y病毒屬簡并引物擴增四川感病辣椒樣品，結(jié)果得到辣椒脈斑駁病毒的一個分離物Pp3。Lee等（2013）采用DNA分子標記進行辣椒品種抗ChiVMV性篩選試驗，確定了從亞洲幾個國家收集到的抗辣椒葉脈斑駁病毒抗病品系中的抗病品種，發(fā)現(xiàn)了對ChiVMV的主要抗性特征。楊華兵等（2014）通過對21個煙草品種摩擦接種，分析其癥狀特征及對ChiVMV的抗性，結(jié)果表明，云南省煙草主栽品種缺乏對ChiVMV的抗性。劉建等（2015）首次構(gòu)建了ChiVMV侵染性克隆的簡易方法及其全長cDNA，轉(zhuǎn)錄出病毒RNA。馬鈴薯Y病毒屬病毒CP基因的N端序列和長度在種間存在明顯差距，但同種病毒的不同株系間保持著90%以上的同源性（Ward et al，1992；Joseph and Savithri，1999）。Ravi等（1997）以ChiVMV CP基因的N端氨基酸序列與其他馬鈴薯Y病毒屬成員進行了比較，其同源性不超過30%，但其抗胰蛋白酶核心TRC的比較表現(xiàn)出近80%的同源性。因此，CP基因和3'-UTR序列的相似性被認為是馬鈴薯Y屬病毒最重要的分類依據(jù)。【本研究切入點】前人對ChiVMV的研究集中在分子鑒定、全基因組測序、抗病品種鑒定等方面，且在貴州相鄰省份四川、云南已發(fā)現(xiàn)ChiVMV（Ding et al.，2011），但目前尚未見用CP基因和3'-UTR序列作為貴州辣椒ChiVMV株系鑒定及分化的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以GenBank已公布的ChiVMV CP基因和3'-UTR序列的保守序列設(shè)計特異性引物，采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測貴州辣椒疑似病毒樣品的ChiVMV發(fā)生分布情況，并將PCR產(chǎn)物進行回收、連接、轉(zhuǎn)化，對克隆的保守序列進行測序，并用相關(guān)軟件對序列進行比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，以明確貴州ChiVMV流行株系及分子變異情況，為該病毒的基因功能及與宿主植物互作關(guān)系研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗樣品

2015年7月收集疑似辣椒ChiVMV（表現(xiàn)植株矮小，葉片狹小、卷曲，葉片深綠、淺綠相間，葉片黃化等病毒病典型癥狀）樣品共39份，其中貴陽市16份、大方縣9份、黔西縣8份、遵義市6份。

Trizol Reagent、TOP Taq DNA聚合酶、pEASY-T5載體、DH5α感受態(tài)細胞、Trans2KTM Plus II DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTPs和RNase-free Water均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。膠回收試劑盒購自Axygen公司。三氯甲烷、5mol/L NaCl 溶液、異丙醇、75%乙醇、ddH2O及其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 試驗方法

采用RT-PCR對ChiVMV的保守序列進行擴增。先用Trizol Reagent試劑盒提取辣椒病毒病樣品RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA合成反應(yīng)體系20.0 μL，其中組分1包括Random 6 mers（50 μmol/L）1.0 μL、dNTP Mixture（10 mmol/L）1.0 μL、模板RNA 2.0 μL、RNase-free Water ddH2O加至20.0 μL。待組分1變性反應(yīng)完成加組分2，包括5×PrimeScript II Buffer 4.0 μL、RNase Inhibitor（40 U/μL）0.5 μL（20 U）、Prime Script II RTase（200 U/μL）1.0 μL（200 U）、RNase-free ddH2O加至20.0 μL。反應(yīng)條件：組分1在65 ℃下反應(yīng)5 min，立即置冰上冷卻2 min；然后加入組分2，30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，95 ℃失活5 min。

PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：10×PCR Buffer 5.0 μL，10 mmol dNTP 1.6 μL，10 mmol/L正、反向引物各0.5 μL（根據(jù)基因號KC711056的ChiVMV全長設(shè)計特異性引物：ChiVMV-F：5'-GGATTGATGGTTTGGTGTATTGAG-3'，ChiVMV-R：5'-CATTCCATTAAGGTGGGA-3'），Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，cDNA 5.0 μL，滅菌ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。反?yīng)結(jié)束后取3.0 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測擴增結(jié)果。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒連接到pEASY-T5載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞后涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 3 核苷酸序列分析

利用DNAMAN（Version：7.0.2.176）對侵染貴州辣椒的ChiVMV CP基因和3'-UTR進行序列拼接及分析，運用MEGA 5.0的CLUSTALW程序進行基因組比對，并將貴州分離物與NCBI中BLAST比對同源性較近的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 RT-PCR擴增結(jié)果

對從貴陽、遵義、大方和黔西采集的39份疑似ChiVMV辣椒樣品進行RT-PCR檢測，結(jié)果（圖1）顯示，貴陽有2份樣品、遵義有3份樣品、大方有1份樣品和黔西有1份樣品共有7份樣品能檢測到670 bp的片段（檢出率為17.95%），片段大小均與預期設(shè)計相符，條帶單一，穩(wěn)定性強。

2. 2 核苷酸序列分析結(jié)果

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)克隆測序后得到ChiVMV的部分CP基因序列和3'-UTR，將序列輸入NCBI中Standard Nucleotide BLAST進行比對分析，結(jié)果顯示貴州ChiVMV株系的部分CP基因和3'-UTR序列與來源于四川辣椒上的ChiVMV株系的同源性最高，為99%，與我國其他省份及印度ChiVMV株系的同源性大于90%（表1）。

根據(jù)GenBank已公布的部分ChiVMV的CP基因和3'-UTR序列與外源生物燕麥壞死斑點病毒（ONMV，AY377938），以及同屬的辣椒葉脈斑駁病毒（PVMV，DQ645484）和辣椒斑駁病毒（PepMoV，EU586121）進行序列比對分析，由MEGA 5.0構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2）可知，系統(tǒng)發(fā)育進化樹分為四大分支，第一支是貴州、我國其他省份及韓國株系，第二支為印度株系，第三支是為PepMV和PVMV，第四支為外源屬病毒ONMV。

從ChiVMV分離的地理來源分析，大方和黔西株系與四川和云南分離物株系聚為一支，而貴陽和遵義株系單獨聚為一小支。表明貴州辣椒ChiVMV存在一定的地域分化，黔西和大方ChiVMV與云南和四川的親緣關(guān)系較近，貴陽和遵義與黔西和大方株系存在一定差異。總的來說，貴州株系與四川和云南株系的親緣關(guān)系最近。我國各省份株系與韓國株系聚為另一支，說明在亞洲區(qū)域內(nèi)我國和韓國株系的親緣關(guān)系較近，與印度的親緣關(guān)系較遠，而且我國株系也存在一定的遺傳進化趨勢。從馬鈴薯Y病毒屬株系分化來看，所有ChiVMV株系聚為一個大支，PepMV和PVMV單獨聚為另一支，說明ChiVMV與同屬的PepMV和PVMV的親緣關(guān)系較近，與外源生物ONMV的親緣關(guān)系較遠。

3 討論

本研究對從貴州4個市（縣）采集的39份疑似ChiVMV辣椒樣品進行RT-PCR，結(jié)果共檢測出7份ChiVMV陽性樣品，檢出率為17.95%；選取貴陽、遵義、黔西和大方各1份陽性樣品進行ChiVMV的CP基因和3'-UTR序列克隆測序，通過序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹可知，貴州ChiVMV株系與四川和云南株系親緣關(guān)系最近，與韓國株系親緣關(guān)系較近，與劉健等（2016）檢測出湖南和福建辣椒上有ChiVMV存在，且與源于韓國的ChiVMV株系聚在一個亞簇，以及海南文昌分離物研究結(jié)果相符。但這些研究并未對各省不同地區(qū)的ChiVMV株系分化進行研究，而本研究中對貴州省4個辣椒主產(chǎn)區(qū)感染ChiVMV的辣椒樣品進行研究，發(fā)現(xiàn)黔西和大方株系與貴陽和遵義株系分別聚為不同小支，說明株系間具有一定的地理差異。

由于不同株系變異可能使基因重組產(chǎn)生不同的功能，而這些基因功能是與宿主植物互作關(guān)系研究的基礎(chǔ)，因此，ChiVMV株系分離鑒定是開展該病毒寄主范圍、癥狀類型、蚜傳效率、致病性、致病機理等研究的前提。本研究僅對貴州部分具有代表性的辣椒種植區(qū)的ChiVMV辣椒樣品進行檢測研究，而貴州全省辣椒種植區(qū)ChiVMV發(fā)生危害情況及株系分化有待進一步研究。

4 結(jié)論

對貴州4個市（縣）采集的39份疑似ChiVMV辣椒樣品的RT-PCR檢測結(jié)果顯示，黔西和大方株系與貴陽和遵義株系間存在一定的地域分化，表明貴州ChiVMV株系已存在明顯的株系分化現(xiàn)象。

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（責任編輯 麻小燕）