甘藍飼養(yǎng)小菜粉蝶幼蟲對兩種寄主植物葉片汁液的行為及電生理反應

摘要：【目的】探討小菜粉蝶幼蟲對2種寄主植物（甘藍和旱金蓮）葉片汁液的行為及電生理反應，為闡明植食性昆蟲寄主植物選擇機制提供一定的理論依據(jù)。【方法】小菜粉蝶幼蟲孵化后飼養(yǎng)在甘藍葉片上，選用進入5齡24～48 h的小菜粉蝶幼蟲供試；植物葉片榨出汁液，用行為試驗雙選法測試幼蟲對汁液的行為反應，用頂端記錄法測試幼蟲側栓錐和中栓錐味覺感受器對汁液的電生理反應。【結果】行為試驗結果表明，甘藍飼養(yǎng)小菜粉蝶幼蟲取食含有甘藍葉片汁液的玻璃纖維濾紙圓片極顯著多于取食含有旱金蓮葉片汁液的圓片（P<0.001）。電生理試驗表明，側栓錐味覺感受器對2種葉片汁液的電生理反應均顯著強于中栓錐味覺感受器（P<0.01），且側栓錐味覺感受器對旱金蓮葉片汁液的電生理反應顯著強于甘藍葉片汁液（P<0.01），而中栓錐味覺感受器的反應對兩者無顯著差異（P>0.05）；側栓錐味覺感受器有3個味覺神經(jīng)元對葉片汁液有反應，中栓錐味覺感受器只有2個味覺神經(jīng)元對葉片汁液有反應，且側栓錐味覺感受器中味覺神經(jīng)元1和神經(jīng)元2對旱金蓮葉片汁液的反應頻率極顯著強于對甘藍葉片汁液的反應頻率（分別為P<

0.01和P<0.001），味覺神經(jīng)元3對兩者反應無顯著差異（P>0.05）；中栓錐味覺感受器中味覺神經(jīng)元1和神經(jīng)元2對旱金蓮葉片汁液和對甘藍葉片汁液的反應頻率則無顯著差異（P>0.05）。【結論】甘藍飼養(yǎng)小菜粉蝶幼蟲對旱金蓮葉片汁液有拒食行為，這種拒食行為與側栓錐味覺感受器中相關味覺神經(jīng)元的激活有關。小菜粉蝶幼蟲側栓錐味覺感受器對2種寄主植物葉片的反應均顯著強于中栓錐味覺感受器，說明在對寄主植物的探測上側栓錐味覺感受器可能起到更重要的作用。

關鍵詞： 小菜粉蝶幼蟲；植物葉片汁液；栓錐感受器；味覺神經(jīng)元；電生理頂端記錄

中圖分類號： S433.4 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）07-1225-06

0 引言

【研究意義】植物的化學構成為昆蟲取食選擇提供了重要信息，鱗翅目昆蟲幼蟲通過感受這些信息來區(qū)別寄主植物與非寄主植物（Schoonhoven and van Loon， 2002）。植物汁液的組成成分十分復雜，多年來該領域的研究一直集中在純化合物激發(fā)相關昆蟲特定味覺神經(jīng)元反應上（Zhou et al.， 2009，2010； 湯清波等，2015； Ma et al.， 2016）。但在自然界中昆蟲幼蟲取食時直接接觸的是植物汁液，它們得到的所有化學信息均來自于汁液，植物汁液對其生活史影響深遠（Thoming et al.， 2013； Pontes et al.， 2014； Cahenzli et al.， 2015； Petit et al.， 2015； Proffit et al.， 2015）。因此，研究昆蟲幼蟲對寄主植物葉片汁液的反應，對于闡明植食性昆蟲探測和選擇寄主植物的機理有十分重要的意義。【前人研究進展】昆蟲味覺系統(tǒng)中的味覺神經(jīng)元在尋找寄主植物中起著決定性作用，鱗翅目昆蟲幼蟲的味覺神經(jīng)元主要存在于下顎須、外顎葉及內唇的腹面（Schoonhoven and van Loon， 2002； Tang et al.， 2015）。在所有味覺感受器中，外顎葉上的側栓錐味覺感受器（Lateral styloconic sensillum， L-sensillum）和中栓錐味覺感受器（Medial styloconic sensillum， M-sensillum）在取食行為的選擇中起著決定性作用。每個栓錐感受器內有5個神經(jīng)元，其中一個起機械固定作用，其余4個則是味覺功能神經(jīng)元，這4個味覺功能神經(jīng)元的樹突會伸到感受器的頂部，接近栓錐感受器頂端小孔的位置，在那里與不同的味覺物質接觸反應以獲取味覺信息；所有的鱗翅目昆蟲均有取食抑制素味覺神經(jīng)元，這種神經(jīng)元的激活能抑制甚至停止昆蟲的取食行為（Wada-Katsumata et al.， 2013）。甘藍（Brassica oleracea L. var. gemmifera cv. Cyrus）和旱金蓮（Tropaeolum majus L. cv. Glorious Gleam）是小菜粉蝶（Pieris rapae）幼蟲的天然寄主植物，但前期有研究表明，孵化后飼養(yǎng)在甘藍上的小菜粉蝶幼蟲會拒絕取食旱金蓮，盡管旱金蓮也是其天然寄主植物之一（Huang and Renwick， 1995）。在昆蟲幼蟲味覺感受領域，前人研究基本集中在鑒定單個味覺神經(jīng)元對一些純化合物的反應上。del Campo等（2001）研究發(fā)現(xiàn)煙草天蛾（Manduca sexta）幼蟲在對茄科植物和非茄科植物的取食選擇中，95%有茄科植物取食經(jīng)歷的幼蟲會選擇茄科植物，表明茄科植物中的一種化合物idioside D是誘導其取食的信號，電生理研究也發(fā)現(xiàn)有取食茄科植物經(jīng)歷的幼蟲中栓錐味覺感受器有1個對idioside D強烈敏感的細胞。燈蛾（Grammia geneura）幼蟲的側栓錐味覺感受器有對氨基酸反應的細胞，在中栓錐味覺感受器也有2～3個味覺細胞能感受多種氨基酸，其中1個味覺細胞還能對蔗糖、葡萄糖、海藻糖和梓醇起反應（Bernays and Chapman， 2001a， 2001b）。一直以來，昆蟲對天然植物葉片汁液的反應研究極少，其中最重要的原因是植物汁液中含有多種化合物，從而引發(fā)多個味覺神經(jīng)元的反應，給量化分析味覺神經(jīng)元的活動帶來了困難（van Loon et al.， 2008）。【本研究切入點】目前，關于植食性昆蟲對天然寄主植物葉片汁液的行為和電生理反應研究尚未見詳細報道。【擬解決的關鍵問題】采用行為試驗調查甘藍飼養(yǎng)的小菜粉蝶幼蟲對甘藍和旱金蓮葉片汁液味覺行為上的差別；采用電生理頂端記錄技術調查相關味覺神經(jīng)元對這2種天然寄主植物葉片汁液的神經(jīng)脈沖反應，探索昆蟲幼蟲對寄主植物葉片汁液的行為和其栓錐感受器內味覺神經(jīng)元對葉片汁液的電生理反應，以期為揭示植食性昆蟲對寄主植物的選擇機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試甘藍和旱金蓮在溫室中培育，培育溫度18～22 ℃。小菜粉蝶幼蟲飼養(yǎng)在甘藍葉片上，飼養(yǎng)室溫度25～28 ℃，濕度60%～70%，光周期L∶D=16∶8。電生理試驗昆蟲為5齡蛻皮后24～48 h的小菜粉蝶幼蟲，測試前饑餓2 h。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 葉片汁液制備 選取新鮮的甘藍和旱金蓮葉片，用蒸餾水潤洗，空氣中晾干。把葉片剪成小塊，用一個不銹鋼壓榨器快速榨出汁液，濾除葉片殘渣，即為甘藍葉片汁液和旱金蓮葉片汁液，立即放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｐ袨樵囼炛校杭幼⒃诓ＡЮw維濾紙（購自Sigma-Aldrich公司）上；電生理試驗中，稀釋汁液裝入毛細玻璃管中用于測定昆蟲幼蟲味覺栓錐感受器的反應。

1. 2. 2 行為試驗 采用雙選法，使用玻璃纖維濾紙作為取食介質。用打孔器將玻璃纖維濾紙打成直徑1 cm的圓片，分別將10 μL稀釋葉片汁液用移液槍均勻加注于濾紙圓片上。取饑餓后的5齡幼蟲置于培養(yǎng)皿中間，將2片加注甘藍葉片汁液的濾紙圓片和2片加注旱金蓮葉片汁液的濾紙圓片依次交叉放置于培養(yǎng)皿的內部邊緣， 當有任意約50%甘藍葉片汁液圓片或旱金蓮葉片汁液圓片被取食后，剩下的圓片面積用惠普掃描儀掃描，用Scion Image（Scion Image for Windows 4.3，Scion Co. http：//www.scioncorp.com）軟件計算表面積（Zhou et al.， 2009）。行為試驗在25 ℃溫室中進行，重復20次。

1. 2. 3 電生理試驗 采用頂端記錄電生理技術（Tang et al.， 2014a， 2014b）記錄不同味覺神經(jīng)元對各種純的或混合化合物的神經(jīng)反應，并略有改進。具體方法：切下5齡幼蟲的頭部，將銀電極的一端從切口小心插入，并盡量突出下顎葉，使2個栓錐感受器暴露；電極的另一端與前置放大器相連，后者與電生理信號處理系統(tǒng)連接在一起；分別將2種植物葉片汁液注入一尖端直徑約30 μm的玻璃電極中，玻璃電極接到微動操作儀上；小心將玻璃電極的開口與幼蟲栓錐感受器的頂端相接觸，溶液會激發(fā)味覺神經(jīng)元反應，其信號經(jīng)前置放大器放大后傳入電生理信號處理系統(tǒng)，再轉化處理成可識別的電生理脈沖信號。味覺神經(jīng)元脈沖反應的計數(shù)，是從0 s到反應后60 s。味覺神經(jīng)元脈沖信號的識別根據(jù)其反應振幅與反應模式進行判定（van Loon et al.， 2008； Zhou et al.， 2009）。試驗重復12次。

1. 3 統(tǒng)計分析

應用SPSS 17.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，其中行為試驗數(shù)據(jù)采用成對t檢驗，電生理試驗數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗。

2 結果與分析

2. 1 甘藍飼養(yǎng)小菜粉蝶幼蟲對不同植物葉片汁液的行為反應

味覺行為試驗結果（圖1）顯示，甘藍飼養(yǎng)小菜粉蝶幼蟲取食甘藍葉片汁液的玻璃纖維濾紙圓片面積極顯著大于旱金蓮葉片汁液圓片（P<0.001），小菜粉蝶幼蟲取食含有甘藍葉片汁液圓片的面積在60 mm2以上，而取食含有旱金蓮葉片汁液的圓片面積僅10 mm2左右。說明甘藍飼養(yǎng)的小菜粉蝶幼蟲在取食行為選擇上極大偏好于甘藍葉片汁液中的化學物質，而傾向于拒絕旱金蓮葉片汁液中的化學物質。

2. 2 味覺感受器對不同植物葉片汁液的總電生理反應頻率

從栓錐味覺感受器總的電生理反應頻率來看（圖2），無論是對甘藍葉片汁液還是旱金蓮葉片汁液，側栓錐味覺感受器的反應頻率均顯著高于中栓錐味覺感受器（P<0.01），且側栓錐味覺感受器對旱金蓮葉片汁液的反應頻率顯著高于對甘藍葉片汁液的反應頻率（P<0.01），但中栓錐味覺感受器對甘藍葉片汁液和旱金蓮葉片汁液的反應頻率無顯著差異（P>0.05）。

2. 3 不同味覺神經(jīng)元對不同植物葉片汁液的電生理反應頻率

根據(jù)不同反應振幅及反應模式可知，側栓錐味覺感受器有3個味覺神經(jīng)元對甘藍葉片汁液及旱金蓮葉片汁液有反應（圖3），味覺神經(jīng)元1振幅最高，但反應頻率低，味覺神經(jīng)元2振幅次之，反應頻率最高，味覺神經(jīng)元3振幅最低，反應頻率介于神經(jīng)元1與神經(jīng)元2之間（圖3和圖4）。中栓錐味覺感受器有2個味覺神經(jīng)元對甘藍葉片及旱金蓮葉片汁液有反應（圖3），味覺神經(jīng)元1振幅低，反應頻率也低，味覺神經(jīng)元2振幅高，反應頻率亦高（圖3和圖4）。由圖4可知，側栓錐味覺感受器中味覺神經(jīng)元1和神經(jīng)元2對旱金蓮葉片汁液的反應頻率極顯著強于對甘藍葉片汁液的反應頻率（分別為P<0.01和P<0.001），味覺神經(jīng)元3對兩者反應無顯著差異（P>0.05）；而中栓錐味覺感受器中味覺神經(jīng)元1和神經(jīng)元2對旱金蓮葉片汁液和對甘藍葉片汁液的反應頻率無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

在自然界中，昆蟲幼蟲主要通過取食寄主植物來生存和發(fā)育，因此，選擇寄主植物是鱗翅目昆蟲幼蟲生命史中的第一步（van Loon et al.， 2008）。昆蟲幼蟲咀嚼植物葉片產生葉片汁液，汁液中含有多種植物次生化合物，幼蟲通過味覺感受器的味覺神經(jīng)元來感受和評價這些化合物從而決定是否取食植物（Zhang et al.， 2013； Stockton et al.， 2016）。甘藍和旱金蓮均是小菜粉蝶的天然寄主植物，新孵化的幼蟲在這兩種植物上均能正常生長發(fā)育，但甘藍和旱金蓮屬于不同種類的植物，其葉片汁液的化學組成差別明顯（Huang and Renwick， 1995）。本課題組研究了孵化后即飼養(yǎng)在甘藍葉片上的小菜粉蝶幼蟲對兩種天然寄主植物甘藍和旱金蓮葉片汁液的行為反應和電生理反應，行為反應試驗結果表明，甘藍飼養(yǎng)小菜粉蝶幼蟲取食甘藍葉片汁液的玻璃纖維濾紙圓片面積極顯著大于旱金蓮葉片汁液圓片，說明旱金蓮葉片汁液中含有小菜粉蝶幼蟲的拒食素。即孵化后飼養(yǎng)在甘藍上的小菜粉蝶幼蟲會拒絕取食旱金蓮，而飼養(yǎng)在旱金蓮上的幼蟲照樣會取食甘藍，這種現(xiàn)象可能與抑制素味覺神經(jīng)元對相關植物次生物質的敏感性降低有關（Zhou et al.， 2009， 2010； Ruiz-Montoya and Nunez-Farfan， 2013； Wada-Katsumata et al.， 2013； Zhang et al.， 2013； Liman et al.， 2014； Tang et al.， 2014a， 2014b， 2015； Ma et al.， 2016）。

植物汁液中所含的化學物質十分復雜，種類繁多，當昆蟲幼蟲接觸到植物汁液時，這些化學物質會激發(fā)幼蟲味覺感受器內多個味覺神經(jīng)元的反應。本研究結果表明，無論是對甘藍葉片汁液還是對旱金蓮葉片汁液，昆蟲幼蟲側栓錐味覺感受器的反應頻率均顯著高于中栓錐味覺感受器，說明在小菜粉蝶幼蟲選擇寄主植物時，側栓錐味覺感受器可能起到更重要的作用。另外，側栓錐味覺感受器對旱金蓮葉片汁液的反應頻率顯著高于對甘藍的反應頻率，而中栓錐味覺感受器對甘藍和旱金蓮葉片汁液的反應頻率無顯著差異，這一結果強烈暗示甘藍飼養(yǎng)的小菜粉蝶幼蟲拒食旱金蓮汁液與側栓錐味覺感受器對旱金蓮葉片汁液的反應有關，很可能其側栓錐味覺感受器中存在對旱金蓮汁液敏感的抑制素味覺神經(jīng)元。

本研究的電生理試驗分析結果表明，側栓錐味覺感受器中有3個味覺神經(jīng)元對植物葉片汁液有反應，而中栓錐味覺感受器只有2個味覺神經(jīng)元對植物葉片汁液有反應，且側栓錐味覺感受器中味覺神經(jīng)元1和神經(jīng)元2對旱金蓮葉片汁液的反應頻率極顯著強于對甘藍葉片汁液的反應頻率。根據(jù)味覺神經(jīng)元的反應模式分析，側栓錐味覺感受器中反應脈沖頻率最高的味覺神經(jīng)元2是一個抑制素神經(jīng)元，其對旱金蓮葉片汁液的反應脈沖頻率極顯著高于甘藍葉片汁液，說明這個抑制素神經(jīng)元有對旱金蓮葉片汁液的敏感感受，可能是甘藍飼養(yǎng)的小菜粉蝶幼蟲拒食旱金蓮的主要原因。

4 結論

甘藍飼養(yǎng)的小菜粉蝶幼蟲對旱金蓮葉片汁液具有拒食行為，這種拒食行為與側栓錐味覺感受器中相關味覺神經(jīng)元的激活有關。小菜粉蝶幼蟲側栓錐味覺感受器對2種寄主植物葉片的反應均顯著強于中栓錐感器，說明在對寄主植物的探測上側栓錐味覺感受器可能起到更重要的作用。

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（責任編輯 麻小燕）