低溫脅迫下苦瓜苗期生理變化與耐冷性評價的關系分析

摘要：【目的】分析低溫脅迫下苦瓜苗期生理變化與耐冷性評價的關系，篩選適宜苦瓜苗期耐冷性評價的取材時期，為提高苦瓜耐冷性評價的準確性和可靠性提供參考依據。【方法】對已知耐冷性存在差異的苦瓜材料MC108、MC45和MC6幼苗進行10 ℃低溫脅迫，分別測定其葉片在脅迫0、2、4、6、8和10 d時的生理指標，繪圖顯示生理指標的變化情況，結合隸屬函數值對各脅迫時期苦瓜耐冷性的評價結果，篩選適宜苦瓜苗期耐冷性評價的取材時期。【結果】耐冷性存在差異的苦瓜材料對冷害脅迫反應機制不同，與低溫脅迫0 d（對照）相比，低溫脅迫第10 d時冷敏材料MC6的可溶性蛋白含量降幅較大，脯氨酸（Pro）含量增加量更多；與MC45和MC6相比，低溫脅迫0、2、4、6、8和10 d時耐冷材料MC108的超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性變幅相對較小。除丙二醛（MDA）含量峰值出現的時間不同外，MC108、MC45和MC6的Pro、可溶性蛋白含量及SOD、POD活性降低的共同時間點均為低溫脅迫處理第10 d。結合隸屬函數值對苦瓜耐冷性的評價結果判斷，低溫脅迫處理第10 d的葉片生理指標適宜作為其苗期耐冷性評價指標。【結論】苦瓜材料幼苗進行10 ℃低溫脅迫處理第10 d是進行苗期耐冷性評價的適宜取材時期。

關鍵詞： 苦瓜；低溫脅迫；生理指標；耐冷性評價

中圖分類號： S642.5 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）07-1237-05

0 引言

【研究意義】苦瓜（Momordica charantia L.）起源于東南亞的熱帶地區，屬喜溫蔬菜，氣溫低于10 ℃則生長發育不良。在春季提早栽培中，苦瓜苗期遇低溫冷害天氣會生長緩慢，甚至形成僵苗而停止生長，影響苦瓜種植范圍的擴大和上市時節的調節，生產上也缺乏耐冷性強且綜合性狀好的苦瓜品種。苦瓜耐冷育種多采用生理生化指標法須首先對育種材料進行苗期耐冷性評價。由于不同苦瓜育種材料對低溫冷害脅迫有不同的反應機制，獲取精確的生理變化指標已成為評價其耐冷性的關鍵。因此，分析低溫脅迫下苦瓜苗期生理指標變化與其耐冷性評價的關系，對促進苦瓜耐冷育種具有重要意義。【前人研究進展】黃玉輝等（2008a，2008b）研究認為，10 ℃脅迫第7 d時苦瓜葉片的丙二醛（MDA）相對增加量、過氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性及可溶性糖含量可作為苦瓜耐冷性評價的指標。利用生理指標變化進行作物耐冷性評價，其低溫脅迫處理方法有3種類型，一是直接利用某一低溫進行相同時間處理（黃玉輝等，2008a，2008b）；二是設置不同溫度梯度進行相同時間處理（許桂芳等，2009）；三是與自然條件下不同環境溫度進行比較（洪永聰等，2009；張曉紅等，2015），其共同點是未設置同一溫度下不同脅迫時間以獲得更精確的生理指標變化情況。張紅梅等（2011）研究發現，低溫弱光（晝溫15 ℃/夜溫7 ℃，80 μmol/8 m2·s）處理10 d后苦瓜的形態學指標、生理及光合指標的綜合隸屬函數值可用于對參試苦瓜材料進行耐低溫弱光性分類。董萬鵬等（2015）研究發現，西番蓮應對低溫的內在變化可反映為生理生化變化，并可用來鑒定與評價其耐冷性。【本研究切入點】目前，對苦瓜材料耐冷性評價由于評價條件、低溫脅迫時間和方法不同，獲得的評價結果也不一致或相互矛盾，降低了耐冷性評價的準確性和可靠性，而利用生理生化指標法對苦瓜苗期進行耐冷性評價時，針對利用生理指標測定適宜取材時期的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】利用已知耐冷性存在差異的苦瓜材料進行苗期低溫脅迫處理，測定其不同脅迫時期葉片的生理指標，篩選苦瓜苗期耐冷性評價的適宜取材時期，為提高其耐冷性評價的準確性和可靠性提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試苦瓜材料為經鑒定存在耐冷性差異的材料MC108、中間材料MC45和冷敏材料MC6，由廣西農業科學院蔬菜研究所提供。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 低溫脅迫處理 苦瓜種子催芽后，將露白種子播于穴盤中，采用同一穴盤不同材料間隔育苗法育苗，按正常方法進行苗期管理。待苗長至4葉1心時移至人工氣候箱中，在濕度90%、溫度10 ℃條件下進行冷脅迫處理2、4、6、8和10 d，以脅迫處理0 d為對照，分別取各脅迫時期苦瓜功能葉，剪碎混均后進行生理指標測定。每處理3次重復，每重復15株。

1. 2. 2 冷害指數測定 處理后第10 d進行冷害指數測定。冷害指數中的冷害級別參照于賢昌等（1998）的方法進行分級。冷害指數=∑（各級冷害株數×冷害級數）/總株數×100。冷害指數與植物的耐冷性呈負相關，冷害指數越低表明植株越耐冷（黃玉輝等，2008a）。

1. 2. 3 干重和鮮重測定 將子葉出土剛露真葉的幼苗置于10 ℃培養箱中進行冷害脅迫處理，處理后第10 d進行干、鮮重測定，以置于室外常溫下生長第10 d幼苗為對照。每處理3次重復，每重復15株。單株重為每重復株數重量的平均值。

1. 2. 4 生理生化指標測定 可溶性蛋白含量用考馬斯亮藍G-250染色法、脯氨酸（Pro）含量用酸性茚三酮法、MDA含量用硫代巴比妥酸法、SOD活性用氮藍四唑還原法、POD活性用愈創木酚法進行測定。

1. 3 統計分析

利用Excel 2003進行數據點折線圖分析，用DPS 3.01進行新復極差方差分析。隸屬函數值的計算公式如下：

綜合隸屬函數值Xi（u）=[∑Xij（u）]/n（j=1）

正向指標隸屬函數Xij（u）=（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin）

負向指標隸屬函數值Xij（u）=1-（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin）

式中，Xij（u）表示第i個材料第j個指標的隸屬函數值；Xij表示第i個材料第j個指標的測定值；Xjmin表示第j個指標在試驗材料中的最小值；Xjmax表示第j個指標在試驗材料中的最大值；Xi（u）表示第i個材料的平均隸屬函數值；n表示指標數。

2 結果與分析

2. 1 供試苦瓜材料的耐冷性

由表1可知，低溫處理10 d時，低溫脅迫苦瓜材料MC6、MC45和MC108間的冷害指數、鮮重和干重等指標均存在極顯著差異（P<0.01），而在室外常溫下生長10 d時，其鮮重和干重差異不顯著（P>0.05），說明低溫脅迫下耐冷性強的苦瓜材料生長速度更快，累積的干物質更多。結合多年的田間鑒定結果，MC108為耐冷材料，MC45為中間材料，MC6為冷敏材料。

2. 2 低溫脅迫對苦瓜生理變化的影響

2. 2. 1 對MDA含量的影響 從圖1可看出，隨著低溫脅迫時間的延長，MC6、MC45和MC108的MDA含量峰值分別在脅迫第2、6和8 d出現，說明MC6的細胞膜在低溫脅迫第2 d即出現較嚴重損傷，耐低溫能力較弱，而MC108的細胞膜在低溫脅迫第8 d才受到損傷，耐低溫能力較強。至脅迫第10 d時，所有參試材料的MDA含量均低于其脅迫0 d（對照）時的含量，說明脅迫第10 d時各參試材料的MDA指標變化達一致，此時的MDA含量可作為苦瓜苗期耐冷性評價指標。

2. 2. 2 對Pro和可溶性蛋白含量的影響 圖2-A顯示，各苦瓜材料的Pro含量均隨著低溫脅迫時間的延長而大量累積，脅迫第6 d時Pro含量有一定幅度下降后繼續累積，至脅迫第10 d時累積到一個很高的量，與脅迫0 d（對照）時相比，耐冷性弱的材料MC6具有更大的增加量，即Pro含量相對值（與對照數值相減獲得的值）與苦瓜的耐冷性呈負相關。從圖2-B可看出，各苦瓜材料的可溶性蛋白含量均隨著低溫脅迫時間的延長而增加，脅迫第8 d時增加至峰值，然后下降，至脅迫第10 d時下降至低于脅迫0 d時（對照）的水平；與脅迫0 d（對照）時相比，耐冷性弱的苦瓜材料MC6具有更大的降幅，即可溶性蛋白含量相對值與苦瓜的耐冷性呈正相關。說明Pro和可溶性蛋白作為苦瓜細胞內的滲透調節物質，其含量隨著低溫脅迫時間延長而變化的趨勢不一致。

2. 2. 3 對POD和SOD活性的影響 圖3-A顯示，低溫脅迫下3個苦瓜材料的POD活性均呈先升高后降低再升高再降低的變化趨勢，脅迫第6 d時出現第2個POD活性變化峰值，然后開始下降，但脅迫至第10 d時3個材料的POD活性均仍高于相應脅迫0 d（對照）時的POD活性，并維持在較高水平，尤其以MC108的POD活性更高。從圖3-B可看出，低溫脅迫下3個苦瓜材料的SOD活性均呈先降低后升高再降低的變化趨勢，脅迫至第4 d時出現SOD活性變化峰值，然后開始下降，至脅迫第10 d時下降至低于相應脅迫0 d（對照）時的水平，尤其以MC6的SOD活性更低。說明同為膜保護系統組成部分的POD和SOD，其活性隨著脅迫時間延長而變化的趨勢不完全一致，其中，與耐冷性弱的材料MC6比，耐冷性強材料MC108葉片的POD活性絕對值一直維持在較高水平，SOD活性絕對值則穩定在一定范圍內。

綜合2.2.1、2.2.2和2.2.3的分析結果可知，耐冷性存在差異的苦瓜材料苗期對冷害脅迫的反應機制不同，用生理生化指標法對其進行耐冷性鑒定應找到生理生化指標變化的共同時間點作為測定鑒定指標的時期，才能提高鑒定和評價的可比性；除Pro含量隨脅迫時間的延長而增加外，其余生理指標均隨脅迫時間的延長而降低，降低的共同時間點均為脅迫處理第10 d，說明此時是所測定生理生化指標共同變化的時間點。因此，初步認為苦瓜苗期低溫脅迫第10 d的生理生化指標適宜作為其耐冷性鑒定指標。

2. 3 綜合隸屬函數值對苦瓜耐冷性評價的檢驗結果

綜合隸屬函數值平均法能消除個別評價指標評價的片面性，使供試材料的耐冷性差異具有可比性，綜合隸屬函數值越大，說明材料耐冷性越強。由表2可知，低溫脅迫第2、4和6 d，冷敏材料MC6和中間材料MC45可評價為耐冷材料；脅迫第8 d后，耐冷性鑒定結果才與供試材料的耐冷性一致，但在脅迫第8 d時耐冷性強材料的MDA含量（圖1）才達峰值，至脅迫第10 d，各指標的變化才一致。可見，脅迫處理第10 d苦瓜葉片的生理指標宜作為苦瓜苗期耐冷性評價指標。

3 討論

3. 1 關于低溫脅迫對苦瓜生理生化變化的影響

本研究結果表明，隨著低溫脅迫時間的延長，耐冷性強的苦瓜材料MC108累積MDA的速率相對較小且出現急劇增加的時間相對較遲，表明MDA是膜質過氧化產物，其含量可反映膜損傷程度，耐冷性強的材料對低溫脅迫有更強和更持久的耐受能力，與黃玉輝等（2008b）對苦瓜、閻世江等（2013）對黃瓜的研究結果一致。

Pro和可溶性蛋白作為植物細胞內重要的滲透調節物質，有助于增加細胞持水能力而增強作物的耐冷性（楊德浩等，2004），前者是水合能力較強的氨基酸，后者為親水膠體性較強的物質。在本研究中，隨著低溫脅迫時間的延長，3個耐冷苦瓜材料的Pro累積均增加，而冷敏材料MC6具有更大的增加量，表明冷脅迫對其傷害更明顯，需增加更多的Pro累積以幫助細胞持水，即其Pro含量絕對值與苦瓜的耐冷性呈負相關。該結果與陳小鳳等（2007）對干旱脅迫時甘蔗Pro增加量與作物耐旱性成負相關的研究結果一致，與董萬鵬等（2015）對西番蓮的研究結果相反，原因可能是不同作物對低溫脅迫的反應機制不一致。

POD和SOD是植物膜保護系統的組成部分，能在逆境脅迫中清除活性氧自由基，維持體內的活性氧代謝平衡、保護膜結構，使植物能在一定程度上忍耐、減緩或抵抗逆境脅迫，其活性與植物抗寒性呈一定的相關性（李美茹等，1995）。在本研究中，隨著低溫脅迫時間的延長，耐冷性強材料MC108葉片的POD活性絕對值一直維持在較高水平，SOD活性絕對值則穩定在一定范圍內，且絕對值的降幅也比冷敏材料MC6小，能使活性氧代謝處于一定的平衡狀態，避免活性氧等各種自由基的大量積累，減輕膜脂過氧化作用，降低細胞膜的破壞程度，與苦瓜的耐冷性成正相關，與閻世江等（2013）對黃瓜的研究結果一致。

綜上所述，在低溫脅迫下，各耐冷苦瓜材料的生理指標變化情況與其實際耐冷性相符，這些指標均可參與進行苦瓜耐冷性綜合評價，并占有一定比重。但為了更加精確地評價不同特性的苦瓜材料，還應測定更多生理指標用來參與苦瓜耐冷性評價。

3. 2 關于篩選苦瓜苗期耐冷性鑒定的適宜取材時期

本研究結果表明，耐冷性存在差異的苦瓜材料對低溫脅迫有不同的反應機制，耐冷性強的材料MC108在脅迫第2、4和6 d可評價為冷敏材料或中間材料，說明在冷脅迫開始時，冷害對其細胞的損害輕，其生理指標變化不明顯。在低溫脅迫第2和4 d，冷敏材料MC6可評價為耐冷材料；在低溫脅迫第6 d，中間材料MC45可評價為耐冷材料，說明耐冷性弱的材料在低溫脅迫開始時細胞即受損傷，表現為生理指標變化明顯。可見，若利用脅迫早期的生理指標進行苦瓜材料耐冷性鑒定和評價，就會降低鑒定的準確性和可靠性。

本研究僅進行苦瓜苗期低溫脅迫10 d處理，脅迫處理10 d后各材料的生理指標變化情況仍有待進一步觀測。

4 結論

利用綜合隸屬函數值對苦瓜耐冷性綜合評價結果進行檢驗，并結合低溫脅迫苦瓜苗期生理指標的變化結果判斷，苦瓜材料幼苗進行10 ℃低溫脅迫處理第10 d是進行苗期耐冷性評價的適宜取材時期。

參考文獻：

陳小鳳，李楊瑞，葉燕萍，莫云川. 2007. 利用葉綠素熒光參數和凈光合速率評價引進禾本科牧草的抗旱性[J]. 草業科學，24（5）：53-57. [Chen X F，Li Y R ，Ye Y P ，Mo Y C. 2007. Drought resistance assessment using chlorophyll fluo-rescence parameters and net photosynthesis in introduced gramineous forage[J]. Pratacultural Science，24（5）：53- 57.]

董萬鵬，羅充，龍秀琴，胡靜，李燕. 2015. 低溫脅迫對西番蓮抗寒生理指標的影響[J]. 植物生理學報，51（5）：771-777. [Dong W P，Luo C，Long X Q，Hu J，Li Y. 2015. Effects of low temperature stress on physiological indexes of cold resistance of Passiflora edulis[J]. Plant Physiology Journal，51（5）：771-777.]

洪永聰，王玉，丁兆堂，張新富. 2009. 越冬期茶樹葉片生理指數分析及抗寒種質材料的篩選[J]. 中國農學通報，25（16）：215-218. [Hong Y C，Wang Y，Ding Z T，Zhang X F. 2009. Cold resistant screening of tea germplasm resources applied by physiological index of leaves in wintering pe-riod[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，25（16）：215-218.]

黃玉輝，羅海玲，韋莉萍，周生茂，方鋒學. 2008a. 苦瓜耐冷性生理指標研究[J]. 廣西農業科學，39（6）：805-807. [Huang Y H，Luo H L，Wei L P，Zhou S M，Fang F X. 2008a. Phy-siological criteria for cold tolerance evaluation in balsam pear[J]. Journal of Guangxi Agricultural Sciences，39（6）：805-807.]

黃玉輝，羅海玲，張曼. 2008b. 不同苦瓜品種種子發芽和苗期耐冷性差異的研究[J]. 長江蔬菜（學術版），（20）：11-13. [Huang Y H，Luo H L，Zhang M. 2008b. Study on cold-resistance of different bitter gourd cultivars in germination and seedling stages[J]. Journal of Changjiang Vegetables，（20）：11-13.]

李美茹，劉鴻先，王以柔. 1995. 植物細胞中的抗寒物質及其與植物抗冷性的關系[J]. 植物生理學通訊，（5）：328-334. [Li M R，Lui H X，Wang Y R. 1995. Antifreexing subatrances in plant cell and relation to cold resistance[J]. Plant Physiology Communication，（5）：328-334.]

許桂芳，張朝陽，向佐湘. 2009. 利用隸屬函數法對4種珍珠菜屬植物的抗寒性綜合評價[J]. 西北林學院學報，24（3）：24-26. [Xu G F，Zhang Z Y，Xiang Z X. 2009. Comprehensive evaluation of cold resistance on four Lysimachia plants by subordinate function values analysis[J]. Journal of Northwest Forestry University，24（3）：24-26.]

閻世江，劉潔，張繼寧，司龍亭. 2013. 低溫對黃瓜若干生理指標的影響[J]. 河北科技師范學院學報，27（2）：12-17. [Yan S J， Liu J， Zhang J N， Si L T. 2013. Effects of low temperature and poor light on physiological index in cucumber[J]. Journal of Hebei Normal University of Science Technology， 27（2）：12-17.]

楊德浩，楊敏生，王進茂，王世蘭，李帥英，葉振魁，Naujoks G. 2004. 歐洲白樺苗期低溫脅迫時膜系統的變化[J]. 東北林業大學學報，32（6）：13-15. [Yang D H，Yang M S，Wang J M，Wang S L，Li S Y，Ye Z K，Naujoks G. 2004. Europe Birch’s membrane system changes under low temperature menace in the period of seedling[J]. Journal Northeast Forestry University，32（6）：13-15.]

于賢昌， 刑禹賢， 馬紅，魏珉. 1998. 不同砧木與接穗對黃瓜嫁接苗抗冷性的影響[J]. 中國農業科學， 31（2）：41-47. [Yu X C， Xing Y X， Ma H， Wei M. 1998. Effect of di-fferent rootstocks and scions on chilling tolerance in grafted cucumber seedlings[J]. Scientia Agriculture Sinica， 31（2）：41-47.]

張紅梅，金海軍，丁小濤，余紀柱. 2011. 低溫弱光下不同苦瓜自交系的生長和生理特性[J]. 上海農業學報，27（3）：21-25. [Zhang H M，Jin H J，Ding X T，Yu J Z. 2011. The growth and physiological characteristics of inbred lines of balsam pear under low temperature and light intemsity[J]. Acta Agriculture Shanghai，27（3）：21-25.]

張曉紅，馮梁杰，楊特武，徐正華，胡立勇. 2015. 冬季低溫脅迫對油菜抗寒生理特性的影響[J]. 植物生理學報，51（5）：737-746. [Zhang X H，Feng L J，Yang T W，Xu Z H，Hu L Y. 2015. Effects of chilling stress on physiological characteristics of rapeseed seedlings in winter[J]. Plant Physiology Journal，51（5）：737-746.]

（責任編輯 思利華）