南美蟛蜞菊葉蛋白提取方法篩選

摘要：【目的】篩選出適合南美蟛蜞菊葉蛋白的提取方法和條件，為其蛋白飼料資源化利用提供技術支持。【方法】通過正交試驗分別優(yōu)化酸加熱法、堿加熱法、鹽析法和有機溶劑法提取南美蟛蜞菊葉蛋白的工藝條件，并對比4種方法的提取效果，確定最佳提取工藝。【結果】4種方法提取的南美蟛蜞菊葉片粗蛋白含量排序為：鹽析法（15.18 mg/g）>酸加熱法（9.97 mg/g）>堿加熱法（9.79 mg/g）>有機溶劑法（7.21 mg/g）。其中，鹽析法的最適提取條件為氯化鈉質量濃度30%、絮凝時間10 min；酸加熱法的最適提取條件為絮凝溫度60 ℃、pH 3、絮凝時間2 min；堿加熱法的最適提取條件為絮凝溫度25 ℃、pH 7、絮凝時間2 min；有機溶劑法的最適提取條件為乙醇體積分數(shù)20%、絮凝時間10 min。絮凝溫度對酸加熱法和堿加熱法提取效率有顯著影響（P<0.05），溶液濃度對鹽析法和有機溶劑法提取效率有極顯著影響（P<0.01）。【結論】綜合比較4種方法提取南美蟛蜞菊葉蛋白的效果，確定鹽析法是提取南美蟛蜞菊葉蛋白的最適方法，其提取效率高、操作簡便、蛋白質活性保持較好，適用于實驗室提取和工業(yè)生產。

關鍵詞： 南美蟛蜞菊；葉蛋白；提取方法

中圖分類號： S567.239；Q949.92 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）07-1274-06

0 引言

【研究意義】隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，我國蛋白飼料供求矛盾日益加劇，預計到2020年我國蛋白飼料供需缺口達4.8×107 t（付亮亮等，2006）。植物葉蛋白是一種極具開發(fā)價值的新型蛋白資源（王震等，2016），已有研究表明利用其作為飼料添加劑替代飼料中某種成分，可獲得良好的飼養(yǎng)效果，如利用苜蓿葉蛋白替代乳牛日糧中50%的葵花籽餅既可提高乳牛產乳量，又提高了乳脂率和乳蛋白產量（強莉，2002）；利用菠菜葉蛋白替代豆粕飼喂蛋雞，可提高蛋雞的生產性能和改善蛋黃顏色（李玉清等，2010）。劉曉庚（1998）對我國分布廣泛的100多種植物進行葉蛋白含量測定，結果表明葉蛋白含量一般為10.00%～20.00%，個別高達32.40%。大力開發(fā)植物葉蛋白資源已成為目前解決蛋白飼料供給缺口的有效途徑之一。南美蟛蜞菊（Wedelia trilobata）又稱三裂葉蟛蜞菊，為菊科（Compositae）多年生草本植物，原產于中、南美洲。最初作為綠化地被植物引進我國，但由于其生長速度快，環(huán)境適應性強，很快逃逸為野生，現(xiàn)已嚴重威脅我國海南、廣東、廣西、云南、福建等省（區(qū)）的生態(tài)系統(tǒng)健康（黃澤文和鄭庭義，2013）。邱賀媛（2004）對8種外來植物的葉蛋白含量進行比較，發(fā)現(xiàn)南美蟛蜞菊葉蛋白含量為8.42%，高于菊科入侵植物薇甘菊（6.10%）、腫柄菊（3.50%）和旋花科入侵植物五爪金龍（5.86%）。梁方方等（2006）、楊家晃等（2010）利用同屬蟛蜞菊鮮草制成干草粉分別飼喂肉兔和鵝，均獲得較好的效果。可見，南美蟛蜞菊作為一種優(yōu)質的蛋白飼料資源極具開發(fā)潛力。若能利用南美蟛蜞菊生長速度快、分布廣、葉蛋白含量高的優(yōu)勢，從中高效提取植物葉蛋白，不僅有利于解決南美蟛蜞菊入侵帶來的生態(tài)問題，還可緩解蛋白飼料供給缺口問題。【前人研究進展】葉蛋白作為飼料蛋白，富含動物必需氨基酸、胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素、多種維生素及礦物質等。目前用于生產濃縮葉蛋白的主要原料有聚合草（李鳳玲和何金環(huán)，2009）、菠菜（李玉清等，2010）、西蘭花（潘行正等，2010）、甘薯（王世寬等，2010）、苜蓿（李萬林和鐘姣姣，2014）、水葫蘆（謝瞰等，2016）等。葉蛋白的提取方法較多，針對特定物種篩選出高效提取葉蛋白的方法和條件是對其進行充分利用的基礎，不少學者在這方面進行了探索。白紅杰等（2009，2010）綜合比較了酸加熱法、堿加熱法、鹽析法和有機溶劑法提取蒙早苦荬菜葉蛋白的效率，結果表明，酸加熱法是提取蒙古苦荬菜葉蛋白的最佳方法，最適提取工藝條件為90 ℃、pH 5、絮凝時間4 min；尹衛(wèi)等（2013）研究紫花苜蓿葉蛋白提取條件，結果表明，在絮凝溫度70 ℃、料液比1∶10、加鹽量1%、絮凝時間5 min、pH 4的條件下提取效果最佳；謝先中等（2016）采用酸化加熱法分別結合聚乙二醇沉淀法、乙醇沉淀法、氯化鈉法提取鬼針草葉蛋白，結果表明，鬼針草葉蛋白提取率排序為酸化加熱法+聚乙二醇沉淀法（29.4 mg/g）>酸化加熱法+乙醇沉淀法（27.9 mg/g）>酸化加熱法+氯化鈉法（24.7 mg/g）>酸化加熱法（23.1 mg/g）>直接加熱法（20.2 mg/g）。【本研究切入點】目前尚無針對南美蟛蜞菊葉蛋白提取工藝條件優(yōu)化的研究報道。【擬解決的關鍵問題】采用酸加熱法、堿加熱法、鹽析法和有機溶劑法4種方法提取南美蟛蜞菊葉蛋白，篩選適合南美蟛蜞菊葉蛋白的提取方法和條件，為其為蛋白飼料資源化利用提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

南美蟛蜞菊采自廣州市番禺區(qū)大學城廣州大學生化樓湖邊。主要試劑：標準結晶牛血清蛋白（LR，廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司）；考馬斯亮藍（LR，廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司）；鹽酸（AR，衡陽市凱信化工試劑股份有限公司）；氫氧化鈉（AR，天津市光復科技發(fā)展有限公司）；氯化鈉（AR，廣州化學試劑廠）；乙醇（AR，上海泰坦科技股份有限公司）。主要儀器設備：OK1081A歐科榨汁機（佛山市順德區(qū)歐科電器有限公司），UV-1100型紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司），320型Thermo Scientific Orion PerpHecT LogRTM測量儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，HWS28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 南美蟛蜞菊葉汁液制備 摘取生長狀況相近、長勢良好的南美蟛蜞菊新鮮葉片100 g，加入300 mL蒸餾水進行榨汁，過濾去渣，得到327 mL原汁液，將其稀釋16倍即為測定粗蛋白含量備用汁液。

1. 2. 2 4種方法提取南美蟛蜞菊葉蛋白 采用酸加熱法、堿加熱法、鹽析法和有機溶劑法提取南美蟛蜞菊葉蛋白，參照白紅杰（2010）的方法進行。酸（堿）加熱法：取5 mL備用汁液置于離心管中，調成不同pH，置于不同溫度水浴鍋中加熱一定時間；鹽析法和有機溶劑法：取5 mL備用汁液置于離心管中，加入等量不同濃度梯度的氯化鈉溶液或乙醇溶液，絮凝一定時間。處理后均3000 r/min離心10 min，棄上清液，加入1 mL蒸餾水，吹打沉淀直至均勻，再加入5 mL考馬斯亮藍溶液，靜置5 min，根據(jù)考馬斯亮藍法（Bradford，1976）測定葉片粗蛋白含量。

酸加熱法和堿加熱法提取葉蛋白時，絮凝溫度、pH和絮凝時間是影響提取效率的3個主要因素（黃新育等，2015），參照白紅杰（2010）的方法分別設5個水平，進行L25（53）正交試驗（表1）。溶液濃度和絮凝時間是影響鹽析法和有機溶劑法的兩個因素，分別設5個水平，進行L25（52）正交試驗，具體因素水平見表2。由于不同試驗方法每支試管加入等量均勻的備用汁液，故采用葉片粗蛋白含量（mg/g）指示葉蛋白提取率，作為評價指標。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2. 1 4種方法提取南美蟛蜞菊粗蛋白含量的正交試驗結果

采用酸加熱法、堿加熱法、鹽析法和有機溶劑法4種方法提取南美蟛蜞菊葉蛋白，分別設計25個試驗組合，得到葉片粗蛋白含量如表3所示。根據(jù)不同試驗組合的葉片粗蛋白含量，對每種提取方法的影響因素及最優(yōu)條件進行統(tǒng)計分析，以確定最佳提取方法。

2. 2 酸加熱法方差分析結果

由表4極差分析可知，酸加熱法提取南美蟛蜞菊葉蛋白的最佳組合為A2B5C1，即最優(yōu)條件為絮凝溫度60 ℃、pH 3、絮凝時間2 min，經驗證試驗，得到葉片粗蛋白含量為9.97 mg/g。方差分析結果（表5）表明，A（絮凝溫度）對酸加熱法提取南美蟛蜞菊葉蛋白效率影響顯著（P<0.05，下同），B（pH）和C（絮凝時間）對其影響不顯著（P>0.05，下同）。

2. 3 堿加熱法方差分析結果

由表6極差分析可知，堿加熱法提取南美蟛蜞菊葉蛋白的最佳組合為A1B1C1，即表3的1號試驗組，最佳提取條件為絮凝溫度25 ℃、pH 7、絮凝時間2 min，由表3可知，葉片粗蛋白含量為9.79 mg/g。方差分析結果（表7）表明，絮凝溫度和pH對堿加熱法提取南美蟛蜞菊葉蛋白效率影響顯著，絮凝時間對其影響不顯著。

2. 4 鹽析法方差分析結果

根據(jù)表8的K值得到鹽析法提取南美蟛蜞菊葉蛋白的最佳組合為D5E5，即氯化鈉質量濃度30%、絮凝時間10 min，由表3可知此條件下葉片粗蛋白含量為15.18 mg/g。方差分析結果（表9）表明，D（溶液濃度）對鹽析法提取南美蟛蜞菊葉片粗蛋白影響極顯著（P<0.01，下同），E（絮凝時間）對南美蟛蜞菊葉片粗蛋白提取影響顯著。

2. 5 有機溶劑法方差分析結果

由表10極差分析結果可知，影響有機溶劑法提取南美蟛蜞菊葉片粗蛋白含量的因素主次排序為D（溶液濃度）> E（絮凝時間），最佳組合為D1E5，即乙醇體積分數(shù)20%、絮凝時間10 min，由表3可知葉片粗蛋白含量為7.21 mg/g。方差分析結果（表11）表明，乙醇體積分數(shù)對有機溶劑法提取南美蟛蜞菊葉蛋白影響極顯著，而絮凝時間影響不顯著。

3 討論

目前提取植物葉蛋白的方法主要有酸（堿）加熱法、鹽析法和有機溶劑法等。酸加熱法和堿加熱法是復合型提取方法，利用在等電點和熱變性雙重因素共同作用下蛋白質變性沉淀（王晉峰等，2003）；鹽析法是通過利用不同濃度的氯化鈉，經不同絮凝時間，使葉蛋白析出；有機溶劑法則是通過加入有機溶劑，降低介電常數(shù)，使葉蛋白析出（白紅杰，2010）。

本研究通過正交試驗優(yōu)化上述4種方法提取南美蟛蜞菊葉蛋白的條件，比較不同條件下葉蛋白中粗蛋白含量，結果表明，酸加熱法提取南美蟛蜞菊葉片粗蛋白的最適條件為絮凝溫度60 ℃、pH 3、絮凝時間2 min，提取得到粗蛋白含量9.97 mg/g；堿加熱法提取的最適條件為絮凝溫度25 ℃、pH 7、絮凝時間2 min，提取得到粗蛋白含量9.79 mg/g；絮凝溫度是影響酸（堿）加熱法提取效率的主要因素，與趙希艷和張澤生（2006）、許英一等（2012）利用酸堿加熱法提取紫花苜蓿葉蛋白的研究結果一致；鹽析法提取的最適條件為氯化鈉質量濃度30%、絮凝時間10 min，提取得到粗蛋白含量15.18 mg/g；有機溶劑法提取的最適條件為乙醇體積分數(shù)20%、絮凝時間10 min，提取得到粗蛋白含量7.21 mg/g；溶液濃度對鹽析法和有機溶劑法提取南美蟛蜞菊葉蛋白效率的影響較大，絮凝時間次之，與白紅杰（2010）提取蒙早苦荬菜葉蛋白的研究結果一致。綜合比較4種方法的提取效果，發(fā)現(xiàn)鹽析法提取南美蟛蜞菊葉片粗蛋白的效率最高，且此法在常溫下進行，蛋白質活性得以保持，操作簡便，適宜于工業(yè)和實驗室采用。酸（堿）加熱法是復合型葉蛋白提取方法，操作過程不但需要調節(jié)pH，而且加熱耗能增加成本，從本研究結果來看，僅限于作為實驗室提取方法。本研究中，有機溶劑法在最佳條件下提取的葉片粗蛋白含量較低，但此法可有效防止在葉蛋白的干燥過程中變硬變黑的問題，故適宜于實驗室小規(guī)模提取優(yōu)質葉蛋白。

此外，本課題組采用上述4種方法對菊科入侵植物薇甘菊和鬼針草葉片粗蛋白含量進行測定，結果表明，堿加熱法提取薇甘菊和鬼針草葉片粗蛋白含量最高，分別為13.42和10.91 mg/g，但低于鹽析法提取南美蟛蜞菊葉片粗蛋白含量（15.18 mg/g）。與其他菊科入侵植物相比，南美蟛蜞菊作為飼料蛋白添加物具有較高的開發(fā)潛力。

4 結論

綜合比較4種方法提取南美蟛蜞菊葉蛋白的效果，確定鹽析法是提取南美蟛蜞菊葉蛋白的最適方法，其提取效率高、操作簡便、蛋白質活性保持較好，適用于實驗室提取和工業(yè)生產。

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（責任編輯 羅 麗）