非小細胞肺癌患者外周血中輔助性T細胞17與調節性T淋巴細胞平衡變化的研究

劉愛民

·論著·

非小細胞肺癌患者外周血中輔助性T細胞17與調節性T淋巴細胞平衡變化的研究

劉愛民

目的 觀察非小細胞肺癌患者外周血中輔助性T細胞17(Th17)與調節性T淋巴細胞(Treg)平衡關系變化，研究其在非小細胞肺癌發病中機制作用。方法 45例非小細胞肺癌患者(觀察組)應用流式細胞術檢測Th17與Treg平衡關系，并設健康體檢者45例作為對照組進行對比觀察。結果 觀察組Th17表達為(3.51±0.37)%，對照組Th17表達為(2.21±0.35)%，觀察組Th17表達明顯高于對照組(P<0.05)。觀察組中腺癌(22例)、鱗癌(23例)及局限期(Ⅰ～Ⅲ期)(15例)、進展期(Ⅳ)(30例)Th17表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。觀察組Treg表達為(7.82±1.45)%，對照組Treg表達為(4.34±1.05)%，觀察組Treg表達明顯高于對照組(P<0.05)。觀察組中進展期(Ⅳ期)Treg表達為(8.12±1.54)%，局限期(Ⅰ～Ⅲ期)Treg表達為(7.01±1.34)%，2期比較差異有統計學意義(P<0.05)，進展期Treg表達高于局限期。觀察組中腺癌患者與鱗癌患者Treg表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。觀察組Treg/Th17為(2.41±0.84)，對照組Treg/Th17為(2.02±0.44)，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)，觀察組Treg/Th17高于對照組。觀察組中進展期(Ⅳ期)Treg/Th17為(2.62±0.69)，局限期(Ⅰ～Ⅲ期)Treg/Th17為(2.01±0.54)%，2期比較差異有統計學意義(P<0.05)，進展期Treg/Th17高于局限期。結論 非小細胞肺癌患者存在Treg/Th17失衡，且其比值變化與預后具有相關性。

非小細胞肺癌；外周血中輔助性T細胞17；調節性T淋巴細胞；機制研究

肺癌是呼吸系統的常見腫瘤，其發病率及病死率逐年上升，是目前世界上威脅人類生命的頭號殺手[1]。肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，不僅發病率和病死率高，且5年生存率<15%，世界衛生組織(WHO)2001年公布的資料顯示，在過去10年間肺癌發病人數約120萬/年，死亡人數約110萬/年，為全球最主要的癌癥[2]。2008年以來，肺癌的發病率和死亡率已經超過乳腺癌、結腸癌、胃癌和肝癌，嚴重危害人類的健康，成為一個嚴重的公共健康問題[3,4]。調節性T淋巴細胞(Treg)為免疫調節細胞，主要作用是維持內環境動態平衡，是通過接觸分泌抑制轉化生長因子-β(TGF-β)及白細胞介素-10(IL-10)負向調節反應來實現的[5]。外周血中輔助性T細胞17(Th17)為輔助性淋巴細胞，主要通過IL-6及TGF-β的誘導分化產生[6]。Treg、Th17在生物學及分化方面有相互拮抗作用，在腫瘤免疫中Treg/Th17的動態平衡有重要意義[7]。我們應用流式細胞術檢測非小細胞肺癌Th17、Treg表達及Treg/Th17的變化，研究Treg/Th17在非小細胞肺癌發病中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年4月至2016年9月我院腫瘤科門診非小細胞肺癌患者45例為觀察組，男26例，女19例；年齡50～62歲，平均(56.18±6.70)歲；病程3～8個月，平均(6.23±1.35)個月；腺癌22例，鱗癌23例；分期：局限期(Ⅰ～Ⅲ期)15例，進展期(Ⅳ)30例。同時選擇同期在我院健康體檢者45例為對照組，男24例，女21例；年齡49～60歲，平均(55.32±6.26)歲。2組性別比、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 診斷及納入標準

1.2.1 診斷標準:①經細胞學或病理學診斷為非小細胞肺癌(分為肺癌Ⅰ～Ⅳ期)；②Kamofsky(KPS)評分≥60分；③具有≥3個癥狀(即疼痛，疲勞，慢性惡心和厭食/惡病質，睡眠問題，抑郁，或食欲不振)；④埃德蒙頓癥狀評估量表有3個或3個以上條目的平均強度≥4(ESAS，為0至10分)[8]。

1.2.2 納入標準:符合診斷標準者；入組治療期間未接受放療、化療者；無感染患者；血紅蛋白(HGB)≥90μg/L；預計生存時間>3個月；未接受孕激素、腎上腺皮質激素及代謝激素治療；無嚴重心臟病及糖尿病史、無消化道梗阻、營養吸收障礙和血栓現象；未接受腸內或腸外高營養。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 儀器與試劑：CD3PE-Cy5抗體、CD4FITCPE抗體、CD8AFITC抗體、CD25APC抗體、人Treg染色體試劑盒、Foxp3抗體及同型對照IgG2，均購自美國eBioscience公司；佛波酯、離子霉素、布雷菲德菌素A、FIX&PERM試劑盒均購自美國ENZO公司；淋巴細胞分離液(Ficoll-Hypaque)、流式細胞儀分析儀為美國BD公司產品；固定破膜劑購自美國Invitrogen公司。

1.3.2 標本收集及保存：受試者(均未接受放化療及手術治療前者)清晨空腹狀態下采集外周靜脈血 4ml，分為2份，每份2ml，分別加入肝素鈉抗凝管中，離心20min，分離出單核細胞。

1.3.3Th17細胞流式細胞術測定：將2ml靜脈血肝素抗凝分離出單核細胞溶液加入布雷菲得菌素A、離子霉素、佛波酯工作液中，然后將試管放入細胞培養箱中，37℃條件下培養5h，培養后的培養液分2份，均為100μl，分別置于2個流式管中，即Th17細胞管和同型對照管，并做好標記。在Th17細胞管和同型對照管中均加入推薦量CD3及CD8抗體，室溫避光15min后再采用流式細胞儀進行檢測。

1.3.4Treg細胞流式細胞術測定：將2ml靜脈血肝素抗凝分離出單核細胞溶液加入CD25抗體5μl和CD4抗體20μl，混合均勻后室溫避光15～20min，然后再分別加入1ml固定/破膜稀釋液，4℃避光30min，之后將2支試管均離心，棄去上清液，再加入胞膜內結合的免疫熒光Foxp3-PE抗體5μl，將對照管加入IgG2α抗體，避光30min后進行胞膜內免疫熒光標記，最后應用流式細胞儀分析。

2 結果

2.1 2組外周血Th17、Treg表達及Treg/Th17比較 觀察組Th17表達為(3.51±0.37)%，對照組Th17表達為(2.21±0.35)%，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)，觀察組Th17表達明顯高于對照組。觀察組Treg表達為(7.82±1.45)%，對照組Treg表達為(4.34±1.05)%，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)，觀察組Treg表達明顯高于對照組。觀察組Treg/Th17為(2.41±0.84)，對照組Treg/Th17為(2.02±0.44)，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)，觀察組Treg/Th17高于對照組。見表1。

組別Th17表達(%)Treg表達(%)Treg/Th17觀察組3.51±0.37*7.82±1.45*2.41±0.84*對照組2.21±0.354.34±1.052.02±0.44

注: 與對照組比較，*P<0.05

2.2 觀察組腺癌患者、鱗癌患者外周血Th17、Treg表達及Treg/Th17比較 觀察組中腺癌(22例)Th17表達為(3.41±0.45)%，鱗癌(23例)Th17表達為(3.21±0.48)%，腺癌患者與鱗癌患者Th17表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。觀察組中腺癌Treg表達為(8.01±1.90)%，鱗癌患者Treg表達為(7.78±1.22)%，腺癌患者與鱗癌患者Treg表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。觀察組中腺癌Treg/Th17為(2.35±0.82)，鱗癌患者Treg/Th17為(2.36±0.70)，腺癌患者與鱗癌患者Treg/Th17比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

類別Th17表達(%)Treg表達(%)Treg/Th17腺癌患者(n=22)3.41±0.458.01±1.902.35±0.82鱗癌患者(n=23)3.21±0.487.78±1.222.36±0.70

2.3 觀察組中局限期、進展期患者外周血Th17、Treg表達及Treg/Th17比較 觀察組中局限期(Ⅰ～Ⅲ期)(15例)Th17表達為(3.36±0.54)%，進展期(Ⅳ)(30例)Th17表達為(3.46±0.42)%，局限期患者與進展期患者Th17表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。觀察組中進展期(Ⅳ期)Treg表達為(8.12±1.54)%，局限期(Ⅰ～Ⅲ期)Treg表達為(7.01±1.34)%，2期比較差異有統計學意義(P<0.05)，進展期Treg表達高于局限期。觀察組中進展期(Ⅳ期)Treg/Th17為(2.62±0.69)，局限期(Ⅰ～Ⅲ期)Treg/Th17為(2.01±0.54)%，2期比較差異有統計學意義(P<0.05)，進展期Treg/Th17高于局限期。見表3。

類別Th17表達(%)Treg表達(%)Treg/Th17局限期患者(n=15)3.36±0.547.01±1.34*2.01±0.54*進展期患者(n=30)3.46±0.428.12±1.542.62±0.69

注: 與對照組比較，*P<0.05

3 討論

觀察結果表明，2組Th17表達比較差異有統計學意義(P<0.05)，觀察組Th17表達明顯高于對照組；觀察組中腺癌、鱗癌患者及局限期(Ⅰ～Ⅲ期)、進展期(Ⅳ)患者Th17表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。2組Treg表達比較差異有統計學意義(P<0.05)，觀察組Treg表達明顯高于對照組；觀察組中進展期(Ⅳ期)、局限期(Ⅰ～Ⅲ期)患者Treg表達比較差異有統計學意義(P<0.05)，進展期Treg表達高于局限期。觀察組中腺癌患者與鱗癌患者Treg表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。2組Treg/Th17比較差異有統計學意義(P<0.05)，觀察組Treg/Th17高于對照組。觀察組中進展期(Ⅳ期)、局限期(Ⅰ～Ⅲ期)Treg/Th17比較差異有統計學意義(P<0.05)，進展期Treg/Th17高于局限期。說明Th17、Treg細胞在非小細胞肺癌的發生、發展中具有重要意義，患者存在Treg/Th17增高，且其比值變化與預后具有相關性，反映預后的負性指標，調節Treg/Thl7的比例可作為免疫治療的一種新的方向。

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056001 河北省邯鄲市中心醫院門診部

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