不同咀嚼負荷對幼兔髁突軟骨內印度豪豬蛋白-人甲狀旁腺激素相關蛋白通路表達的影響

閻帆 馮劍穎 劉晨燕 王盼 孫哲 施昌勁

浙江中醫藥大學口腔醫學院，杭州 310053

·基礎研究·

不同咀嚼負荷對幼兔髁突軟骨內印度豪豬蛋白-人甲狀旁腺激素相關蛋白通路表達的影響

閻帆 馮劍穎 劉晨燕 王盼 孫哲 施昌勁

浙江中醫藥大學口腔醫學院，杭州 310053

目的 分析不同咀嚼負荷作用下，幼兔髁突軟骨內印度豪豬蛋白（Ihh）-人甲狀旁腺激素相關蛋白（PThrP）通路表達的差異性，探討咀嚼應力負荷對髁突軟骨Ihh-PThrP信號通路的影響。方法選取10 d齡幼兔48只，隨機分為硬食組和軟食組，分別喂以同種顆粒狀（硬食）和粉狀（軟食），于飼養的第2、4、6、8周處死。采用蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組織化學、免疫印跡、實時定量熒光聚合酶鏈反應檢測Ihh和PThrP mRNA和蛋白的動態變化。結果HE染色顯示硬食組髁突軟骨厚度高于軟食組的厚度；第2、4、6、8周，Ihh蛋白、PThrP蛋白和mRNA表達量在兩組中呈遞減趨勢；軟食組中Ihh和PThrP蛋白以及mRNA表達量顯著低于硬食組。結論較低的咀嚼負荷會造成髁突軟骨生長因子Ihh和PThrP分泌減少，Ihh-PThrP通路表達遲緩，軟骨發育受阻礙；適當的咀嚼負荷對髁突的正常發育有至關重要的作用。

髁突軟骨； 咀嚼力； 印度豪豬蛋白； 甲狀旁腺激素相關蛋白

髁突軟骨作為髁突生長區，其形成與髁突發育和改建有著直接聯系[1-2]。髁突軟骨是一種繼發性軟骨，在形成過程中受到內部生長因子調控和局部周圍環境影響的共同作用[3-5]。咀嚼壓力作為局部環境影響因素，對髁突軟骨形態結構發育具有重要的作用[6-7]。Kato等[8]研究證實，流質食物造成幼鼠髁突發育遲緩。本課題組前期研究[9]證明，咀嚼壓力不足可能導致髁突軟骨發育遲緩。咀嚼壓力不僅導致髁突軟骨發育遲緩，同時亦會影響軟骨內重要生長因子及其相關信號通路的表達[3]。

印度豪豬蛋白（Indian hedgehog，Ihh）和人甲狀旁腺激素相關蛋白（parathyroid hormone-like related protein，PThrP）已被證實是髁突軟骨發育過程中調節髁突軟骨細胞增殖分化的重要因子[10-11]。哺乳動物胚胎時期，Ihh和PThrP被觀察到在軟骨內大量分泌[11]，但隨著生長發育高峰到來，二者表達量逐步降低[12]。Jahan等[13]已證實胚胎期的下頜制動能夠改變Ihh蛋白分泌，從而影響髁突發育。Huang等[14]的實驗表明，Ihh和PThrP對于壓力改變十分敏感。

本研究通過改變髁突咀嚼壓力，觀察Ihh和PThrP在髁突軟骨內基因表達量及蛋白分泌和分布的差異性，分析Ihh-PThrP通路與咀嚼負荷間的關系，為進一步研究咀嚼壓力對髁突生長發育的影響提供參考。

1 材料和方法

1.1 動物分組與模型建立

選取10 d齡健康未斷奶幼兔48只，隨機分為硬食組和軟食組，分別喂以硬食顆粒飼料和由同種顆粒飼料碾磨而成的粉末狀飼料。實驗第1～14天，幼兔以母乳和飼料混合喂食，在實驗第2周（幼兔28 d齡）斷奶。幼兔每周稱重，生病及健康狀況不良的幼兔剔除實驗。幼兔分別于實驗第2、4、6、8周處死。

1.2 標本制備及染色

取幼兔雙側顳下頜關節標本，右側關節樣本在顯微鏡下剝離髁突軟骨，放入液氮保存備用；左側關節標本浸于4%多聚甲醛中24 h，浸于10%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液脫鈣，然后修去多余組織，暴露髁突及關節盤，石蠟包埋，沿正中矢狀面切成3 μm厚的連續切片，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.3 軟骨厚度比較

以骨和軟骨的交界線的長度作為髁突周徑，分為三等分，即前部、中部和后部，再將各部三等分，等分點作為測量點，用Leica Qwin測量軟件測量髁突軟骨厚度，取平均值作為該部位的軟骨厚度（圖1）。

圖1 髁突軟骨劃分示意圖 HE × 100Fig1 Schematic diagram of the divided condylar cartilage HE × 100

1.4 Ihh蛋白免疫組織化學檢測

樣本切成厚3 μm連續切片，烤片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。蒸餾水洗，抗原修復。3%過氧化氫消除內源性過氧化物酶活性，加一抗（Santa Cruz：SC-13088）。4 ℃孵育過夜，加二抗室溫孵育60 min，DAB顯色，蘇木精襯染，鹽酸乙醇分化，封片。Band-Scan 5.0軟件分析軟骨前部光密度平均值。

1.5 實時定量熒光聚合酶鏈反應（polymerase chainreaction，PCR）

提取總RNA。采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8軟件進行PCR引物設計，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及內參序列見表1。各管中加含染料2×PCR TaqMix10 μL；加正反向引物各0.5 μL，向管中加入混合的cDNA各1 μL，各管補加水至20 μL。混勻，CFX384多重實時熒光定量PCR儀中進行95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，63 ℃ 25 s，40個循環。

表1 引物序列和條件Tab1 Primers and conditions

1.6 免疫印跡

總蛋白提取試劑盒（Thermo Pierce：78510）提取總蛋白，采用BCA定量試劑盒進行總蛋白定量。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）電泳分析，轉膜，放入T-TBS，室溫封閉1 h。加一抗雜交，4 ℃孵育過夜。加二抗，室溫孵育1 h。室溫孵育轉印膜，X-ray film曝光，顯影和定影。BandScan 5.0軟件分析條帶的光密度值。

1.7 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計軟件對實驗數據進行分析，配對t檢驗分析軟硬食組間差異，檢驗水準α=0.05。非參數檢驗分析不同年齡組間差異。

2 結果

2.1 髁突軟骨厚度

髁突軟骨層前部最薄，逐漸增厚，后部最厚。軟食組髁突前部軟骨在第 2、4、6、8周時較硬食組薄，差異有統計學意義（P＜0.05）。髁突中部軟骨厚度在不同周齡軟硬食組間差異均無統計學意義。軟食組髁突后部軟骨厚度在第2、4、6周時較硬食組厚，差異有統計學意義（P＜0.05）；第8周時軟硬食兩組后部軟骨厚度接近，差異無統計學意義（表2）。

表2 髁突軟骨前部、中部以及后部厚度比較Tab2 The difference of thickness of anterior, middle and posterior parts in condylar cartilage μm

2.2 Ihh蛋白免疫組織化學檢測結果

Ihh蛋白表達位于髁突軟骨肥大層淺層至纖維層的細胞外基質，肥大層淺層較集中。以時間軸觀察，軟硬食組髁突Ihh蛋白在2周為低表達，4周表達量達到高峰，6周后逐漸下降，8周少量表達（圖2）。

圖2 第2、4、6、8周，不同咀嚼負荷下髁突內Ihh蛋白表達 免疫組織化學染色 × 200Fig2 The expression of Ihh in the condylar cartilage with altered mastication at 2, 4, 6, 8 weeks immunohistochemistry staining × 200

以髁突前中后部位比較分析，各周齡的硬食組Ihh蛋白表達量均較軟食組高，其中前部、中部和后部在4、6、8周硬食組的表達顯著高于軟食組（P＜0.05），其余組間無顯著性差異（表3）。

表3 不同咀嚼負荷下Ihh蛋白在髁突軟骨內的表達量Tab3 The expression of Ihh in the condylar cartilage with altered mastication

2.3 Ihh和PThrP免疫印跡

Ihh和PThrP蛋白表達量硬食組明顯高于軟食組（圖3），實驗第2、4、6、8周表達量逐步減少，不同年齡組間具有差異。經統計學分析，Ihh和PThrP蛋白在第4、6周兩組間差異有統計學意義（P＜0.05），其他同年齡組間差異無統計學意義。第8周，軟硬食組間各蛋白表達量相近（圖4）。

2.4 Ihh和PThrP實時定量PCR

第2周至第4周Ihh和PThrP mRNA表達量升高，第4周達到頂峰，然后逐漸回落，各年齡硬食組的mRNA表達量均高于軟食組。經統計分析，第6周兩組間Ihh mRNA差異具有統計學意義（P＜0.05），PThrP mRNA在第2周和第6周軟硬食組間差異具有統計學意義（P＜0.05），其他同年齡組間差異無統計學意義。第8周，軟硬食組間各mRNA表達量相近（圖4）。

圖3 第2、4、6、8周，不同咀嚼負荷下髁突內Ihh和PThrP蛋白免疫印跡表達Fig3 The expression of Ihh and PThrP proteins in the condylar cartilage with altered mastication at 2, 4, 6, 8 weeks through Western blot

圖4 不同咀嚼負荷下Ihh、PThrP蛋白和mRNA在髁突軟骨內的表達Fig4 The expression of Ihh and PThrP proteins and mRNA in the condylar cartilage with altered mastication

3 討論

髁突軟骨是髁突發育的基礎。Oraj?rvi等[15]證實髁突軟骨對咀嚼負荷壓力的改變非常敏感。適當的咀嚼負荷有助于髁突軟骨細胞增殖，髁突軟骨的正常發育。本研究發現，第2、4、6、8周，硬食組髁突軟骨前部的厚度明顯高于軟食組中軟骨的厚度，尤以前斜面最顯著。Utreja等[16]研究結果顯示，改變幼鼠髁突的機械負荷，會造成幼鼠髁突軟骨細胞增殖分化以及細胞外基質蛋白表達異常，同樣也是在前斜面最明顯。提示了適當的咀嚼壓力有助于促進髁突軟骨細胞，特別是前斜面區軟骨細胞的增殖分化。而咀嚼壓力刺激不足的軟食組，前期髁突軟骨明顯發育滯后。8周后髁突軟骨厚度與硬食組厚度相差無幾。推測可能是由于髁突軟骨細胞增殖活性除受到咀嚼負荷刺激影響外，也受機體生長發育內因素調控，后者在發育后期占主導地位。

Ihh和PThrP是調控髁突軟骨細胞增殖分化的關鍵生長因子[4,10]，促進軟骨細胞的增殖，延緩分化作用，其調控機制直接影響到髁突軟骨細胞的終末分化，二者形成負反饋的表達機制，共同影響髁突發育[17]。近年來研究[3]顯示，不同的咀嚼壓力會導致髁突軟骨內各蛋白和基因的表達量改變，從而影響髁突軟骨發育。根據Deng等[18]的研究，PThrP在胚胎發育期主要分布于肥大細胞層，而PThrP的缺乏會造成髁突形態發育不足[19]，證明PThrP的分泌表達對于髁突發育至關重要。第2、4、6、8周，幼兔進入生長發育高峰，雖然PThrP蛋白和mRNA的表達量總體趨勢降低，但mRNA的表達量在第2～4周先進入高峰，再降低，與之前的研究結果[12,20]均不同，需要實驗進一步驗證。由于PThrP對壓力的敏感性高，本研究中，在不同咀嚼負荷作用下，硬食組中PThrP蛋白和mRNA的表達量明顯高于軟食組。在Jahan等[13]的研究中，下頜骨制動造成髁突咀嚼壓力減小，發現PThrP分泌減少。暗示當咀嚼壓力降低，PThrP分泌受到抑制，進一步得出咀嚼負荷對PThrP的重要性。

Ihh是一個活躍的機械信號傳導因子，能夠將機械信號轉化成生物信號，在調節細胞增殖分化中起著重要作用[13-14]。適當的機械壓力刺激能使Ihh促進軟骨細胞增殖，從而影響髁突軟骨的發育與改建[21]。本研究中可以觀察到Ihh蛋白主要分布于髁突軟骨肥大層淺層至纖維層，與前期的研究結果一致。本實驗觀察到Ihh蛋白在前中后3個部分表達與軟骨生長厚度是相適應的。咀嚼壓力升高，不但刺激Ihh蛋白分泌量升高，進一步促進髁突軟骨快速生長；壓力不足，則使Ihh蛋白分泌減少，軟骨生長緩慢。這一結果提示Ihh與調節髁突軟骨形成代謝有密切聯系。Chau等[11]對出生后幼鼠軟骨內Ihh蛋白主要分布的研究，也證明Ihh蛋白對于軟骨發育具有重要意義。但研究中Ihh免疫組織化學和免疫印跡結果不完全一致，可能是由于免疫組織化學分髁突區段來比較蛋白表達，而免疫印跡則檢測整個髁突軟骨蛋白表達。隨著幼兔進入生長發育高峰期，Ihh蛋白和mRNA的表達量總體為逐步降低，這一總體趨勢與Semevolos等[12]關于軟骨和年齡相關性的研究結果類似。Ihh mRNA的表達量在2～4周進入頂峰，再回落，同Watahiki等[20]研究結果類似，峰值出現的原因需要進一步實驗探究。另外，即使由于發育期咀嚼壓力不同造成Ihh蛋白表達差異，卻并沒有造成生長因子的異常分泌過度或不足。造成這一現象的原因可能是，軟食刺激所產生的弱負荷不足以使髁突產生病理性改變，而較強的咀嚼負荷更容易使髁突產生病變。第2～8周，在不同咀嚼負荷的作用下，硬食組中Ihh蛋白和mRNA的表達量明顯高于軟食組。Chen等[6]通過改變髁突軟骨的壓力，同樣得出當降低咀嚼壓力，Ihh蛋白的表達會降低，表明適當的咀嚼壓力，能夠刺激髁突軟骨內生長因子分泌表達，髁突軟骨細胞增殖加快，從而促進髁突形態結構發育。第8周軟硬食組中Ihh、PThrP的蛋白和mRNA的表達量趨于一致，原因同樣可能與機體內因素調控有關。研究結果提示適當的咀嚼壓力作用有利于Ihh-PThrP通路中蛋白分子的表達，刺激髁突軟骨細胞分化和發育。

綜上所述，髁突軟骨內Ihh-PThrP通路的表達受到不同咀嚼負荷的影響，而弱的咀嚼壓力會阻滯相關生長因子分泌表達，從而延緩髁突軟骨發育。因此，適當的咀嚼負荷對Ihh-PThrP通路表達和髁突發育起到至關重要的作用。

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（本文編輯 杜冰）

Influence on Indian hedgehog-parathyroid hormone-like related protein pathway induced by altered masticatory loading in the condylar cartilage of growing rabbits

Yan Fan, Feng Jianying, Liu Chenyan, Wang Pan, Sun Zhe, Shi Changjing. (College of Stomatology, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Objective To determine the influence of altered masticatory loading on Indian hedgehog (Ihh)-parathyroid hormone-like related protein (PThrP) pathway in the condylar cartilage of growing rabbits.MethodsA total of 48 10-dayold rabbits were randomly divided into two groups and fed different kinds of food, such as solid diet and soft diet. The animals were sacrificed after 2, 4, 6, and 8 weeks. Difference of Ihh and PThrP expression levels induced by altered masticatory loading was tested by hematoxylin-eosin (HE), immunohistochemistry, Western blot, and real-time polymerase chain reaction (PCR).ResultsThe thickness of condylar cartilage and expression levels of Ihh and PThrP proteins and mRNA of the solid diet groups exceeded those of the soft diet groups. The decreasing tendencies of the expression levels of Ihh and PThrP proteins and mRNA were observed at 2, 4, 6, 8 weeks.ConclusionLow masticatory loading may delay or inhibit the development of condylar cartilage and its growing factors Ihh and PThrP. Therefore, masticatory loading plays an important role in the development of condylar cartilage.

condylar cartilage; mastication; Indian hedgehog; parathyroid hormone-like related protein

Q 257

A

10.7518/hxkq.2017.02.004Supported by: The National Natural Science Foundation of China(81200802); Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (Y2111273). Correspondence: Feng Jianying, E-mail: twohorsejy@163.com.

2016-06-13；

2016-11-13

國家自然科學基金（81200802）；浙江省自然科學基金（Y2111273）

閻帆，住院醫師，碩士，E-mail：648467706@qq.com

馮劍穎，副教授，博士，E-mail：twohorsejy@163.com