口腔干預措施對牙周炎大鼠頸動脈牙齦卟啉單胞菌檢出量及C-反應蛋白表達的影響

任秀云 王沖 劉欣 李豪 馬千惠 林牧 石學雪 高晉華

山西醫科大學口腔醫院牙周科，太原 030001

·牙周病學專欄·

口腔干預措施對牙周炎大鼠頸動脈牙齦卟啉單胞菌檢出量及C-反應蛋白表達的影響

任秀云 王沖 劉欣 李豪 馬千惠 林牧 石學雪 高晉華

山西醫科大學口腔醫院牙周科，太原 030001

目的 建立慢性牙周炎（CP）合并高脂血癥（HL）的SD大鼠模型并對其進行口腔干預，檢測大鼠頸動脈局部C-反應蛋白（CRP）的表達情況及牙齦卟啉單胞菌的檢出量，探討牙周炎與動脈粥樣硬化的相關性。方法SD大鼠隨機分為3組，A組為對照組，B組為HL組，C組為CP+HL組。C組分為C1組（不治療組），C2組（基礎治療組），C3組（拔牙組）；C2組又分為C2-1組（單純牙周基礎治療組），C2-2組（牙周基礎治療+米諾環素+抗生素組）；C3組又分為C3-1組（拔除患牙組），C3-2組（拔除患牙+抗生素組）。建模開始15周后隨機處死B組大鼠1只，取頸動脈分叉血管組織進行油紅O染色，觀察到泡沫細胞形成則HL建模成功。建模成功后進行2次口腔干預，干預結束后5周處死所有大鼠，取雙側頸動脈血管分叉處組織，分別采用免疫組織化學法檢測CRP相對含量，16sRNA半定量法檢測樣本中的牙齦卟啉單胞菌的相對含量。結果免疫組織化學結果顯示，B、C組CRP陽性表達明顯高于A組（P＜0.05），與C1組相比，C組各干預組的CRP表達均降低（P＜0.05），其中輔助抗生素組較不加抗生素組陽性表達更低（P＜0.05），C2-2組在各干預組中陽性表達最低。牙齦卟啉單胞菌檢測結果顯示，C1組檢出量最高，明顯高于A、B組（P＜0.05）；C組各干預組的檢出量均較C1組低（P＜0.05），C3-2組最低（P＜0.05）。結論伴HL的牙周炎大鼠不加干預任其發展，頸動脈血管中CRP的表達及牙齦卟啉單胞菌檢出量都明顯增加，血管病變逐漸加重。牙周基礎治療和拔牙均可有效降低頸動脈血管中CRP的表達及致病菌含量，其中牙周基礎治療對CRP表達的降低作用更明顯，拔牙對降低牙周致病菌的作用更有效；基礎治療或拔牙時若輔以局部及全身抗炎藥物，均可以有效提高CRP和牙周致病菌的降低作用。

高脂血癥； 牙周炎； 牙齦卟啉單胞菌； C-反應蛋白； 牙周基礎治療

近年來，慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）與心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）之間的關系越來越受重視。研究[1]證實，牙周狀態不良可能是導致CVD發生的危險因素之一，牙周病患者CVD患病率較健康人高25%～50%。CVD的主要病理基礎是動脈粥樣硬化，慢性感染及其相關的炎癥過程可直接影響動脈粥樣硬化的病理生理學過程，而慢性牙周炎同樣也是一種由牙周致病菌所引起的慢性感染。牙周袋內的菌斑微生物及其毒性代謝產物可隨咀嚼活動通過破損的牙周袋壁軟組織進入血液循環播散至全身，引起反復的無癥狀菌血癥，同時可定植于血管內皮細胞，對心血管系統產生不良影響。本研究通過檢測CP合并高脂血癥（hyperlipidemia，HL）大鼠模型的頸動脈血管組織中牙齦卟啉單胞菌的相對含量，同時對血管局部組織C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）的表達情況進行免疫組織化學檢測，以探討口腔各種干預措施對合并高脂血癥的牙周炎大鼠模型的影響，為臨床合并高脂血癥的牙周炎患者的治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠50 只，雄性，6周齡，體重200～250 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號SCXK（京）2009—0004。

1.1.2 主要試劑與實驗儀器 OlympusDP72型顯微照相系統（Olympus公司，日本）。膽固醇（分析純）、豬膽鹽飼料（北京奧博星生物技術有限公司提供）。維生素D3注射液（上海通用藥業股份有限公司，批號為111111）。阿莫西林膠囊（哈藥集團制藥總廠，批號為A111200318）。甲硝唑片（亞寶藥業集團股份有限公司，批號為120105）。鹽酸米諾環素軟膏（日本SunStar INC公司，批號為1111181）。

1.2 細菌培養及鑒定

本實驗使用的牙周致病菌為牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277標準菌株[2]，由首都醫科大學口腔微生物研究室提供。

1.3 動物分組

將50只SD大鼠分為3組，A組為正常對照組（7只），B組為HL組（8只），C組為CP+HL組（35只）。C組又分為3個組，C1為自然進程組（7只），C2為基礎治療組，C3為拔牙組；C2組再分為單純牙周基礎治療組（C2-1組，7只）和牙周基礎治療+米諾環素+抗生素組（C2-2組，7只），C3組再分為拔牙組（C3-1組，7只）和拔牙+抗生素組（C3-2組，7只）。

1.4 動物建模

1）A組不進行任何干預。2）B組HL模型建立方法[2]如下。一次性腹腔注射維生素D3（每100 g體重注射劑量為0.23 mL），2周內逐漸增加高脂飼料（高脂飼料配方：質量分數1.5%膽固醇+0.2%豬膽鹽+5%豬油+93.3%基礎飼料）直至完全替代普通飼料。15周后隨機處死B組大鼠1只，取其頸動脈分叉處約1 cm血管組織，剝離動脈筋膜，冰凍切片，油紅O染色，觀察紅染泡沫細胞。3）C組為CP+HL組，HL模型建立同上，CP模型建立方法（與HL模型在時間上同步）如下。腹腔注射5%水合氯醛溶液（每100 g體重注射劑量為0.7 mL）麻醉。以大鼠雙側上頜第一、二磨牙作為實驗牙。先用3—0絲線纏繞于0.20 mm的正畸結扎絲上，再將結扎絲以8 字結扎的形式結扎于雙側上頜第一、二磨牙（M1、M2）的牙頸部，定期涂布牙齦卟啉單胞菌懸液并檢查結扎情況[3]。術后15 周（從開始建模起），隨機檢查C組口腔情況，發現大鼠有牙齦紅腫、探診出血、深牙周袋、實驗牙松動等臨床牙周炎表現即為CP建模成功；同時安樂死法隨機處死1只B組大鼠，油紅O染色，若發現有脂質沉積形成，說明HL建模成功，即開始進行口腔干預。

1.5 口腔干預方法

拆除結扎絲后，各組給予不同的口腔干預措施。C1組：任其自然發展，不加任何口腔干預治療措施。C2組：C2-1組分別于建模成功后第2、4周進行牙周基礎治療（包括牙周刮治和根面平整術），每次選擇同側2顆實驗牙；C2-2組，在基礎治療的基礎上局部用米諾環素，每次干預后同時用抗生素（200 mg·kg-1阿莫西林+100 mg·kg-1甲硝唑）灌胃，每日1次，療程3 d。C3-1組基礎治療同步進行2次拔牙，每次拔除同側2顆實驗牙；C3-2組在此基礎上每次拔牙后加用抗生素（200 mg·kg-1阿莫西林+100 mg·kg-1甲硝唑）灌胃，每日1次，療程3 d。

1.6 標本采集及處理

實驗組大鼠進行2次牙周干預，干預結束后5周處死所有大鼠，取雙側頸動脈血管分叉處約1 cm組織進行檢測。左側血管組織經固定包埋后以1.5 μm厚度橫斷切片，進行CRP免疫組織化學染色，觀察染色強度，并使用醫學圖像分析系統（BI-2000），對所有切片進行半定量分析，以頸動脈分叉處內側為測量部位，細胞質出現棕黃色染色為CRP陽性，按照分層抽樣法在每個部位隨機選擇5個陽性區域，測定該部位的灰度值，染色程度越深，灰度值越小。右側血管新鮮組織置于-70 °C保存，放入無菌Eppendorf管中，應用德國Analytik Jena AG公司提供的細菌DNA提取試劑盒，采用16sRNA法測定各組大鼠頸總動脈血管組織中的牙齦卟啉單胞菌DNA相對含量，具體方法見本課題組前期研究[2]。

1.7 統計學分析

用SPSS 13.0統計學軟件處理各組數據，組間比較采用完全隨機設計資料的方差分析，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 頸動脈血管組織的CRP表達

頸動脈血管組織CRP表達的定位結果見圖1。

圖1 頸動脈血管壁CRP的表達 免疫組織化學染色 × 400Fig1 CRP expression in carotid artery immunohistochemical staining × 400

A組（正常對照組），血管壁形態正常，無明顯增厚，彈性纖維排列整齊，未見CRP陽性表達（圖1A）。B組（HL組），血管壁明顯增厚，內膜下可觀察到脂質沉積，內中膜可見大量泡沫細胞（圖1B中箭頭示），CRP陽性表達，泡沫細胞的細胞質呈黃褐色著色，平滑肌細胞變性、萎縮，彈性纖維排列紊亂。C1組（CP+HL自然進程組）內膜下觀察到多個明顯的動脈粥樣硬化斑塊病灶、脂質核并有鈣鹽沉積（圖1C中黃色箭頭），泡沫細胞（圖1C中紅色箭頭）散在，平滑肌細胞萎縮變性，細胞數目減少，并向內膜遷移，導致內膜增厚，CRP呈強陽性表達且著色呈深褐色，彈性纖維萎縮甚至斷裂。C2-1組（CP+HL基礎治療組），可見血管壁增厚，內膜下散在脂質沉積，泡沫細胞較多，CRP陽性表達，呈黃褐色著色，平滑肌細胞部分變性，彈性纖維排列較為整齊（圖1D）。C2-2組（CP+HL基礎治療+米諾環素+抗生素組），可見稍增厚的內中膜，有陽性表達區，呈棕黃色至黃褐色，泡沫細胞較少，平滑肌細胞少量變性，彈性纖維排列較為整齊（圖1E）。C3-1組（CP+HL拔牙組），血管壁厚薄不均，平滑肌細胞層觀察到多個脂質核，可見鈣化壞死組織、纖維帽，細胞數目顯著減少，CRP強陽性表達，泡沫細胞較少（圖1F）。C3-2組（CP+HL拔牙+抗生素組），可見血管壁增厚，大量泡沫細胞，CRP陽性表達呈黃褐色，平滑肌細胞變性萎縮，彈性纖維排列紊亂（圖1G）。

將CRP免疫組織化學染色結果進行半定量分析，結果見表1。陽性染色強度與灰度值呈反比，即陽性染色越強，則灰度值越小，分析結果可見：不同組的差異有統計學意義（F=102.190，P=0.000），其中B、C組灰度值均小于A組（P＜0.05），C1組灰度值最低；與C1組相比，C組各干預組（C2-1、C2-2、C3-1、C3-2）中除C3-1組外，其灰度值差異均有統計學意義（P＜0.05），其中C2-2組灰度值最高；C3-2組灰度值大于C3-1組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 頸動脈血管組織牙齦卟啉單胞菌DNA相對含量

頸動脈血管組織牙齦卟啉單胞菌DNA的相對含量見圖2和表2。

表1 CRP在各組頸動脈血管壁陽性表達的灰度值Tab1 Gray values of CRP positive expression in carotid artery in different groups n=7, x±s

圖2 頸動脈部分樣本的聚合酶鏈反應擴增產物電泳結果Fig2 Electrophoresis results of polymerase chain reaction amplification product of carotid artery samples

表2 牙齦卟啉單胞菌在各組頸動脈血管壁的相對含量Tab2 The relative expression of Porphyromonas gingivalis in carotid artery in different groups n=7, x±s

由圖2可見，所有大鼠的頸總動脈分叉區組織標本均擴增出預期條帶，牙齦卟啉單胞菌檢出率為100%。每份標本使用通用引物和細菌特異性引物進行聚合酶鏈式反應擴增后，擴增產物的電泳結果表現不完全相同。經16sRNA半定量檢測，牙齦卟啉單胞菌在各組中的相對含量見表2。由表2可見，C1組最高，達到1.22±0.07，明顯高于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；與C1組相比，C組各干預組（C2-1、C2-2、C3-1、C3-2）的相對含量均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；在基礎治療組，C2-2組牙齦卟啉單胞菌的相對含量較C2-1組更低（P＜0.05）；所有干預組（C2-1、C2-2、C3-1、C3-2）中，C3-2組牙齦卟啉單胞菌的相對含量最低（P＜0.05），提示拔牙+抗生素的應用在降低牙齦卟啉單胞菌含量方面更有效。

3 討論

目前已有大量流行病學及實驗數據支持牙周炎可促進動脈粥樣硬化疾病進程這一觀點，CRP作為聯系這兩大炎癥性疾病的重要炎癥標志物，其作用已經得到了充分的驗證[4-5]。

本課題組在前期研究[2-3]中發現，牙周干預治療不同時期血清CRP的含量呈現動態變化，牙周基礎治療、單純藥物治療以及拔除患牙等口腔干預措施在短期內都可能增加動脈粥樣硬化的風險，而長期效果則顯示可能會降低該風險。本實驗在前期研究基礎上，取大鼠處死后雙側頸動脈血管組織，一側血管組織采用免疫組織化學法檢測CRP的相對含量，另一側組織采用16sRNA的方法檢測牙齦卟啉單胞菌的相對含量，結果發現：自然進程組血管病變最嚴重，出現動脈粥樣硬化斑塊、纖維帽及鈣鹽沉積，血管CRP陽性表達及細菌相對含量最高，提示伴有HL的牙周炎大鼠如果不予治療任其病變發展，可能會加重其血管病變，并且CRP和牙齦卟啉單胞菌可能均參與了該病變的過程。

DeStefano等[6]的研究發現，牙周治療能夠降低包括血清CRP在內的一些炎癥因子的濃度。本實驗進行口腔干預后，各干預組與自然進程組相比，血管壁CRP陽性表達弱，血管病變程度減輕，這與De-Stefano等[6]的研究結果一致。本實驗中基礎治療輔助局部米諾環素和服用甲硝唑組的血管最接近正常對照組，各干預組的頸動脈血管局部CRP表達及牙齦卟啉單胞菌檢出量均降低，其中基礎治療輔助局部米諾環素和服用甲硝唑組CRP的陽性表達最低。這提示在牙周基礎治療的基礎上加用局部及全身藥物可能會有助于頸動脈血管的改善。這與本課題組前期血清CRP變化的研究結果一致[2]，均提示對合并HL的牙周炎患者進行治療時，輔以局部及全身藥物治療，可能會降低有創治療引起的全身炎癥反應加劇而可能造成CVD發生的風險。拔牙組結果顯示，單純拔牙對頸動脈血管造成的風險可能不亞于自然進程組，拔牙后輔以甲硝唑則可顯著降低該風險。這提示臨床對于合并HL的牙周炎患者，即使是拔除不能保留的牙周炎患牙，也應該輔以全身藥物以降低風險。

各型牙周致病菌中，牙齦卟啉單胞菌是證據充分的牙周致病菌，各類研究報告的檢出率各有不同，84%～100%不等[7-8]。本實驗結果顯示：與自然進程組和牙周基礎治療組相比，拔牙組的頸動脈血管組織牙齦卟啉單胞菌的相對含量顯著下降（P＜0.05），拔牙時輔以抗生素組的細菌相對含量最低（P＜0.01），這提示在降低血管內牙齦卟啉單胞菌含量方面，拔牙措施較常規牙周基礎治療措施更徹底。由此推測，臨床上及時拔除無法保留的松動患牙，可能更有利于降低牙周組織及頸動脈血管中牙周病原菌的數量。Takamatsu等[9]曾采用DNA探針法檢測牙周基礎治療對牙周致病菌檢出率的影響，發現牙周基礎治療可使牙齦卟啉單胞菌減少，與本研究結果一致。值得注意的是，本實驗在所有的頸動脈標本中均檢測到牙齦卟啉單胞菌，檢出率為100%。Ford等[10]采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測動脈粥樣硬化斑塊，牙齦卟啉單胞菌的檢出率為100%；另外的研究[11-12]則較低，分別為26%和21.6%。本研究中，對照組也檢測出牙齦卟啉單胞菌，提示該細菌可能是口腔常駐菌。統計學分析顯示，雖然對照組與HL組均有牙齦卟啉單胞菌的檢出，但組間差異有統計學意義，二者與HL+CP組間的差異也均有統計學意義（P＜0.01）。由此推測：牙齦卟啉單胞菌作為口腔常駐菌，在健康牙周組織內即存在，且易通過咀嚼等口腔運動隨血液循環播散定植于血管分叉處，但此時菌量很少，并不會導致血管的炎癥改變。本課題組將進一步對牙周組織內牙齦卟啉單胞菌進行檢測，以驗證此結論。

綜上所述，伴有HL的牙周炎大鼠如果不干預任其病變發展，頸動脈血管的動脈粥樣硬化病變會明顯加重，并且CRP和牙齦卟啉單胞菌可能均參與了病變過程。進行各種口腔干預措施時，拔牙在降低血管內口腔致病菌含量方面有優勢，但是牙周基礎治療對改善血管局部炎癥反應較拔牙更有效；但二者均屬于侵入性治療方法，其造成的炎癥反應有加劇動脈粥樣硬化病變的風險，輔助局部和全身抗生素應用則可以有效降低風險。臨床上對于此類患者的治療應綜合考慮各方面因素，選出最佳方案。

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（本文編輯 吳愛華）

Effects of oral interventions on carotid artery in rats with chronic periodontitis for the detection of Porphyromonas gingivalis and the expression of C-reactive protein

Ren Xiuyun, Wang Chong, Liu Xin, Li Hao, Ma Qianhui, Lin Mu, Shi Xuexue, Gao Jinhua. (Dept. of Periodontology, School of Stomatology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

Objective This study aimed to establish a SD rat model of chronic periodontitis (CP) merged with hyperlipidemia (HL), perform periodontal treatment, detect the expression of partial C-reactive protein (CRP) and Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) in the rat carotid artery, and explore the relationship between periodontitis and atherosclerosis.MethodsSD rats were randomly divided into three groups: control group (A), HL group (B), and CP+HL group (C). Group C rats were divided into natural process group (C1), scaling and root planning group (C2), and tooth extraction group (C3). Group C2 rats were randomly divided into C2-1 (scaling and root planning group) and C2-2 (scaling and root planning+minocyline+systemic antibiotics group). Group C3 rats were randomly divided into C3-1 (tooth extraction group) and C3-2 (tooth extraction+systemic antibiotic group). One rat from group B was randomly selected and sacrificed after 15 weeks. Subsequently, the carotid vascular tissue was collected for oil red O staining. Modeling was successful when foam cell formation was observed. Periodontal treatments were conducted twice, and euthanasiawas performed after the experiment. Moreover, double-carotid artery bifurcation was carried out to detect the expression of CRP and P. gingivalis. Immunohistochemical and 16sRNA semiquantitative methods were used to detect the CRP expression and the relative contents of P. gingivalis, respectively.ResultsImmunohistochemical results showed that the CRP-positive expression in groups B and C was significantly higher than that in group A (P＜0.05). The CRP-positive expression in other group C rats were significantly lower than that in group C1 (P＜0.05). The CRP-positive expression in group C2-2 was the lowest among the groups (P＜0.05). The relative quantity of P. gingivalis in group C1 was the highest and significantly higher than that in groups A and B (P＜0.05). The relative quantities of P. gingivalis in groups C2-1, C2-2, C3-1, and C3-2 were significantly lower than that in group C1 (P＜0.05), and the quantity in group C3-2 was the lowest (P＜0.05).ConclusionRats with CP associated with HL will increase the CRP expression and oral bacteria quantity on carotid artery, and lesions will gradually aggravate. Interventions, such as periodontal basic treatment and tooth extraction, could improve carotid artery lesions. The basic treatment with local and systemic anti-inflammatory drugs exerts the most satisfactory effect on local CRP expression. Tooth extraction with antibiotics is an effective method on reducing oral bacteria in carotid artery. Periodontal basic treatment associated with local and systemic antiflammatory drugs can obviously improve the effect.

hyperlipidemia; periodontitis; Porphyromonas gingivalis; C-reactive protein; periodontal basic treatment

R 781.4

A

10.7518/hxkq.2017.02.016

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81271144, 31050002); The Natural Science Foundation of Shanxi Province (2010011050-1). Correspondence: Ren Xiuyun, E-mail: rxy611@163.com.

2016-09-30；

2016-12-02

國家自然科學基金（81271144，31050002）；山西省自然科學基金（2010011050-1）

任秀云，副教授，博士，E-mail：rxy611@163.com

任秀云，副教授，博士，E-mail：rxy611@163.com