丹皮酚對牙齦卟啉單胞菌誘導骨髓來源巨噬細胞功能的影響

陳筑 宿凌愷

1.貴陽市口腔醫院牙體牙髓病科，遵義醫學院附屬貴陽口腔醫院，貴陽 550002；2.浙江大學醫學院附屬口腔醫院牙體牙髓病科，杭州 310000

丹皮酚對牙齦卟啉單胞菌誘導骨髓來源巨噬細胞功能的影響

陳筑1宿凌愷2

1.貴陽市口腔醫院牙體牙髓病科，遵義醫學院附屬貴陽口腔醫院，貴陽 550002；2.浙江大學醫學院附屬口腔醫院牙體牙髓病科，杭州 310000

目的 觀察丹皮酚對牙齦卟啉單胞菌作用下對體外培養的小鼠骨髓來源巨噬細胞（BMM）炎性因子分泌及向破骨細胞分化能力的影響，并探討其作用機制。方法體外分離獲得小鼠生長良好的BMM，加入不同濃度丹皮酚溶液處理1 h，再加入牙齦卟啉單胞菌進行24 h誘導刺激。采用流式細胞術檢測炎癥相關蛋白程序性死亡分子配體1（PD-L1）的表達量，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測細胞上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）及白細胞介素-6（IL-6）水平；在核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）刺激后的BMM中加入不同濃度的丹皮酚溶液處理1 h后，加入牙齦卟啉單胞菌刺激，采用抗酒石酸性磷酸酶（TRAP）染色觀察破骨細胞形成情況，Western blot檢測破骨細胞形成相關蛋白TRAP和核因子κB受體活化因子（RANK）的表達。結果丹皮酚在10～50 μmol·L-1的范圍內，對BMM無毒性作用。流式細胞術結果提示丹皮酚可以抑制牙齦卟啉單胞菌誘導PD-L1的表達，并存在劑量依賴效應。ELISA實驗證明丹皮酚能以劑量依賴性方式抑制BMM釋放TNF-α、IL-1β及IL-6（P＜0.01）。牙齦卟啉單胞菌可以明顯誘導BMM分化形成破骨細胞；TRAP染色顯示丹皮酚各濃度組能抑制BMM向破骨細胞分化；Western blot結果顯示丹皮酚抑制TRAP和RANK表達且存在劑量依賴效應。結論丹皮酚可以劑量依賴方式抑制牙齦卟啉單胞菌誘導的BMM炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌及其向破骨細胞分化的能力。

丹皮酚； 牙齦卟啉單胞菌； 骨髓來源巨噬細胞； 破骨細胞； 炎癥； 分化

慢性牙周炎是導致成人失牙的最常見的慢性感染性炎癥疾病[1]。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）是牙周炎的主要致病菌，被認為是牙周毒力最強的致病菌之一。牙齦卟啉單胞菌能產生大量毒力因子，參與牙周炎發生、發展及牙周組織的破壞過程[2-3]。在慢性牙周炎組織中，巨噬細胞在宿主免疫反應中擔當重要作用，具有趨化作用，并能集中在炎癥部位，發揮強大的抗原呈遞和吞噬作用。有報道顯示牙齦卟啉單胞菌可以激活宿主免疫細胞巨噬細胞，誘導炎癥相關基因轉錄，產生促炎癥因子分泌，如腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1及IL-6等，誘導炎癥反應的發生，具有強烈的細胞毒性和組織損傷性；并在殺死病原體同時，也導致牙周結締組織損傷和牙槽骨吸收[4]。正常生理狀態下，牙槽骨的骨改建是一終身動態且和諧的重塑過程，由成骨細胞和破骨細胞調節的骨形成和骨吸收完成。其中破骨細胞是人體內唯一具有吸收骨質功能的細胞，是一種多核的巨核細胞，來源破骨前體細胞及單核巨噬細胞。慢性牙周炎主要臨床特征為牙槽骨吸收，即有過量的破骨細胞形成，骨吸收多于骨形成，最終導致牙槽骨吸收，牙齒脫落。因此，如何控制巨噬細胞的炎癥反應及其過度向破骨細胞分化，是減少牙周組織破壞的關鍵。

丹皮酚（paeonol）是從牡丹根皮及蘿摩科徐長卿提取的主要活性成分，具有抗菌消炎、免疫調節、鎮靜解痙、退熱止痛等藥理作用[5]。抗炎方面，丹皮酚能夠下調TNF-α誘導的血管內皮細胞炎性因子的表達，抑制內皮細胞炎癥反應；丹皮酚還可抑制脂多糖誘導的星形膠質細胞的炎性因子分泌。此外，丹皮酚能抑制由核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）誘導的破骨細胞形成[6]。然而，目前其在抑制牙齦卟啉單胞菌誘導的牙周炎癥反應的作用報道較少。因此，本研究通過觀察丹皮酚作用下骨髓來源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophage，BMM）分泌和表達細胞炎性因子及向破骨細胞形成的影響，為丹皮酚在牙周炎治療中的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶（Gibco公司，美國），丹皮酚、淋巴細胞分離液Ficoll、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（Sigma公司，美國），抗小鼠程序性死亡分子配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）流式抗體（Santa公司，美國），小鼠TNF-α、IL-1β及IL-6酶聯免疫檢測試劑盒（Bioscience公司，美國）。

1.2 細菌培養

牙齦卟啉單胞菌ATCC33277菌株（由美國阿拉巴馬大學牙學院張平教授惠贈）接種于富胰酪胨瓊脂平板（含有5%去纖維蛋白綿羊血、1%含酵母提取物、5 μg·mL-1氯化血紅素、1 μg·mL-1甲萘醌），37 ℃厭氧（10%H2、2%CO2和85%N2）培養5～7 d，生化鑒定、傳代。細菌收獲，離心，洗滌。利用分光光度計在580 nm波長檢測細菌光密度值（optiacl density，OD），以確定細菌總數。

1.3 細胞獲取

本實驗選用8～10周齡雌性C57BL/6小鼠（獲得美國阿拉巴馬大學醫學倫理委員會批準），斷頸處死。無菌條件下去除鼠股骨和脛骨游離附著軟組織。切斷長骨兩端，使用裝有α-10的25號注射針反復沖洗骨髓。通過機械分散法將骨髓細胞充分打散，培養在加濕7.5%CO2培養箱中，37 ℃過夜。次日，收獲非貼壁細胞，利用Ficoll提取試劑盒（分離淋巴細胞與單核細胞），獲得破骨細胞前體細胞。

1.4 流式細胞儀檢測BMM中PD-L1的表達

將收獲的前體細胞培養于含10%FBS的α-MEM培養基中，按照相應處理進行分組，對照組：不加刺激；陽性刺激組：直接加牙齦卟啉單胞菌刺激，其感染復數（multiplicity of infection，MOI）=10；模型組：不同濃度（10、30和50 μmol·L-1）的丹皮酚預處理1 h，加入牙齦卟啉單胞菌（MOI=10）。

將各組細胞分別用流式細胞熒光分選技術（fluorescence activated cell sorting，FACS）緩沖液洗滌2次，調整細胞濃度為每100 μL FACS緩沖液中含1× 106個細胞，進行抗體孵育。每組細胞中分別加入0.5 μL PE標記抗小鼠PD-L1單克隆抗體，避光條件下37 ℃孵育0.5 h。再用FACS緩沖液洗滌2次，重懸于300 μL FACS緩沖液中，上流式細胞儀BDcaliber檢測BMMs細胞中PD-L1陽性表達百分率。

1.5 酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定細胞上清液

取生長狀態良好的細胞，以濃度為每毫升8×103個接種96孔板，待生長至60%～70%融合時按1.4中的分組給藥刺激后，收集細胞培養上清液。按ELISA試劑盒說明，分別測定各組細胞培養上清中細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度。

1.6 破骨細胞培養及染色

細胞模型處理條件和藥物濃度依據文獻和預實驗結果[7]。按濃度為每毫升5×104個將細胞接種于24孔細胞培養板，在RANKL和巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）刺激后的BMM中，按1.4分組情況，加入不同濃度的丹皮酚溶液處理1 h后，加入MOI=50的牙齦卟啉單胞菌進行刺激，誘導破骨細胞形成。4 d后，根據本實驗組以前操作步驟進行TRAP染色。

1.7 Western blot檢測

各組細胞培養48 h后，利用蛋白酶抑制劑和RIPA裂解混合液（1︰100）提取蛋白質，BCA法檢測蛋白濃度后，將各組蛋白按相同濃度進行變性處理，條件為95 ℃下煮沸5 min。配膠上樣后，凝膠電泳。半干法轉膜，將樣本轉至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h PVDF膜，分別孵育于抗小鼠核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）和TRAP的兔抗小鼠單克隆一抗中，4 ℃搖床過夜。再在室溫條件下孵育在羊抗兔IgG二抗中1 h，TBST洗膜5次，每次5 min。電化學發光（electrochemilu minescence，ECL）液發光后，暗室曝光。

1.8 統計學分析

采用SPSS 19.0統計學軟件對實驗數據進行分析，計量資料參數采用均數±標準差表示，采用兩樣本t檢驗對結果進行分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 丹皮酚對牙齦卟啉單胞菌誘導BMM表達PD-L1的影響

經流式細胞術檢測，牙齦卟啉單胞菌作用BMM細胞24 h后，細胞PD-L1蛋白顯著上升；同陽性刺激組相比，濃度為10、30和50 μmol·L-1的丹皮酚溶液呈濃度依賴性抑制牙齦卟啉單胞菌上調PD-L1蛋白的水平，表明丹皮酚可能通過抑制PD-L1激活來減輕牙齦卟啉單胞菌誘導的BMM細胞炎癥反應。而不同濃度的丹皮酚單獨處理后，對PD-L1的表達影響較小（圖1）。

圖1 流式細胞術檢測BMM表面PD-L1的陽性表達率Fig1 The expression of PD-L1 in the BMM by flow cytometry

2.2 丹皮酚對牙齦卟啉單胞菌誘導BMM細胞炎性因子分泌的影響

在陽性刺激組中，牙齦卟啉單胞菌作用BMM 24 h后，細胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高（P＜0.01）。而在模型組中，分別加入10、30和50 μmol·L-1丹皮酚后，各濃度組呈濃度依賴性抑制BMM分泌細胞炎性因子，IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著下調（P＜0.05或P＜0.01），表明丹皮酚對牙齦卟啉單胞菌誘導的BMM細胞炎癥反應具有明顯的抑制作用。為確定丹皮酚單獨作用BMM是否會產生炎性刺激，在BMM中加入不同濃度丹皮酚溶液后，發現各組細胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α水平較空白對照組無明顯差異（P＜0.05），表明丹皮酚在該濃度范圍作用24 h對BMM無顯著炎癥反應（表1）。

表1 各組細胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較Tab1 Expression of IL-1β, IL-6 and TNF-α in different groups cells supernatant ng·L-1,±s

表1 各組細胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較Tab1 Expression of IL-1β, IL-6 and TNF-α in different groups cells supernatant ng·L-1,±s

注：**與陽性刺激組比較，P＜0.01；***與陽性刺激組比較，P＜0.001。

組別IL-1βIL-6TNF-α對照組41.86±10.010556.7±27.85027.03±13.050 10 μmol·L-1丹皮酚對照組36.51±9.590526.0±2.96016.88±6.095 30 μmol·L-1丹皮酚對照組54.41±8.326481.2±4.4626.55±0.608 50 μmol·L-1丹皮酚對照組189.80±56.230447.2±3.25614.93±1.994陽性刺激組906.20±22.9307 172.0±25.0001 319.00±27.370牙齦卟啉單胞菌+10 μmol·L-1丹皮酚組34.48±26.310***4 977.0±72.160**621.10±85.850***牙齦卟啉單胞菌+30 μmol·L-1丹皮酚組48.09±12.380***2 637.0±138.200***267.10±10.670***牙齦卟啉單胞菌+50 μmol·L-1丹皮酚組53.61±3.067***872.8±26.610***277.90±53.680***

2.3 丹皮酚對牙齦卟啉單胞菌誘導BMM分化破骨細胞能力的影響

對各組細胞進行TRAP染色及計數。用RANKL預處理細胞24 h后，在培養基中去除，加入牙齦卟啉單胞菌刺激4 d后，大量破骨細胞形成。同陽性刺激組相比，10、30和50 μmol·L-1丹皮酚能顯著抑制牙齦卟啉單胞菌誘導的破骨細胞形成（P＜0.05），抑制能力呈濃度依賴性遞增。而用RANKL預處理細胞24 h后，加入不同濃度的丹皮酚，對RANKL誘導的破骨形成無明顯影響（P＞0.05）（圖2、3）。

圖2 破骨細胞TRAP染色結果 TRAP × 10Fig2 TRAP staining of positive multinucleated osteoclasts TRAP × 10

2.4 Western blot檢測RANK和TRAP蛋白水平

各組細胞RANK和TRAP蛋白表達情況見圖4、5。與陽性刺激組相比，隨著丹皮酚濃度增高，RANK和TRAP蛋白表達明顯減弱（P＜0.05）。上述結果說明，丹皮酚可抑制破骨細胞RANK和TRAP蛋白水平表達。

圖3 破骨細胞TRAP陽性細胞數的統計Fig3 Quantification of TRAP positive multinucleated osteoclasts

圖4 Western blot檢測RANK和TRAP蛋白的表達Fig4 The expression of RANK and TRAP using Western blot

圖5 RANK和TRAP蛋白的表達Fig5 Quantification of RANK and TRAP

3 討論

在牙周炎發生發展過程中，BMM參與的特異性免疫應答起著重要作用，過度免疫反應會破壞牙周組織，導致附著喪失和牙槽骨吸收。牙齦卟啉單胞菌能夠有效刺激免疫細胞產生炎癥反應，BMM受到刺激后產生一系列炎性因子，參與牙周炎的病變發展。有研究[8]發現牙齦卟啉單胞菌能刺激BMM產生大量的IL-1β、IL-6、TNF-α和前列腺素2，這些因子與牙周炎的嚴重程度成正相關。此外，牙齦卟啉單胞菌可直接或間接刺激BMM分化成破骨細胞造成牙槽骨吸收，最終導致牙脫落[9]。因此，抑制牙齦卟啉單胞菌誘導的BMM分泌過量炎性因子和破骨細胞形成對于改善和治療牙周炎起到至關重要的作用。

丹皮酚的抗炎作用已經得到證實。體外實驗發現，丹皮酚可抑制脂多糖誘導的小鼠BMM和小角質細胞釋放IL-6、TNF-α和IL-1炎性因子[10]。對細胞因子的測定中，采用ELISA法，結果顯示牙齦卟啉單胞菌可顯著增加BMM細胞的IL-1β、IL-6和TNF-α分泌，丹皮酚可顯著抑制牙齦卟啉單胞菌誘導BMM炎性因子的釋放，在此結果基礎上，筆者用流式細胞術檢測炎癥相關蛋白PD-L1。PD-L1蛋白是程序性死亡因子（programmed death-1，PD-1）的配體，與自身免疫疾病、慢性炎癥及腫瘤密切相關[11]。在膿毒血癥小鼠動物模型中發現，PD-L1在單核細胞的表達量與IL-6和TNF-α的分泌成正比。本實驗結果顯示，較對照組，隨丹皮酚濃度增高，丹皮酚干預細胞組的PD-L1表達降低。提示丹皮酚可通過抑制PD-L1降低牙齦卟啉單胞菌介導的BMM炎癥因子的釋放。

破骨細胞是人體內唯一具有骨吸收功能的多核巨噬細胞，來源于單核巨噬細胞系統，可以通過消化酶和酸來溶解骨組織完成骨吸收，進而實現骨修復重建。M-CSF和RANKL是破骨細胞分化成熟必不可少的兩個重要因子，它們通過調節破骨前體細胞的增殖、融合、分化等功能來實現破骨細胞分化[12]。本實驗中用BMM原代誘導的方法，該法比較接近體內破骨細胞分化的微環境，被廣泛用于藥物干預和調控方面的研究。在預實驗中發現在M-CSF存在的前提下，牙齦卟啉單胞菌直接作用BMM不能誘導其分化為破骨細胞，只有在RANKL預處理后才能誘導BMM分化為破骨細胞，結果與其他研究[13]結果一致。故本實驗中，在培養體系中加入M-CSF濃度為44 ng·mL-1，RANKL濃度為100 ng·mL-1，預處理24 h去除RANKL后，加入牙齦卟啉單胞菌。本實驗結果顯示經過4 d誘導各濃度丹皮酚組破骨細胞的形成數量均明顯減少，較對照組有顯著性差異，且抑制能力呈濃度依賴性增強，此外，TRAP染色結果顯示，對照組誘導較丹皮酚各組的破骨細胞細胞核多，體型大，提示丹皮酚可以抑制BMM向成熟破骨細胞的分化。RANK和TRAP是破骨細胞形成的重要標志蛋白，在免疫應答、淋巴結形成及炎癥中起著不可或缺的作用[14]。TRAP是破骨細胞的特征性酶，參與骨基質中固體鈣磷礦化底物的降解。RNAK蛋白是位于破骨細胞以及前體細胞表面的Ⅰ型跨膜受體，是RANKL發揮破骨細胞分化作用唯一靶信號受體。只有當RANKL與RANK結合后，才能激活核因子κB等信號通絡，進而啟動破骨細胞的分化。本實驗研究發現，與對照組相比較，丹皮酚各實驗組細胞的TRAP和RANK蛋白量均減少，丹皮酚低濃度組與高濃度組相差也有統計學意義（P＜0.05）。說明丹皮酚可能通過下調RANK及TRAP抑制牙齦卟啉單胞菌誘導的破骨細胞分化成熟。

已有報道丹皮酚可抑制實驗性牙周炎大鼠體內炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌及骨喪失[15]，本研究亦證實丹皮酚能明顯抑制牙齦卟啉單胞菌誘導的BMM炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，PD-L1可能參與了丹皮酚對BMM炎癥反應的抑制作用。同時，丹皮酚能明顯抑制牙齦卟啉單胞菌誘導的BMM破骨細胞分化能力。初步揭示了丹皮酚抑制牙齦卟啉單胞菌誘導BMM炎癥及破骨反應的分子作用機制，為進一步研究丹皮酚防治牙周炎提供了新的實驗依據。

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（本文編輯 杜冰）

Effects of paeonol on the function of bone marrow-derived macrophage from Porphyromonas gingivalis-induced mice

Chen Zhu1, Su Lingkai2. (1. Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Guiyang Hospital of Stomatology, Affiliated Guiyang Hospital of Stomatology, Zunyi Medical University, Guiyang 550002, China; 2. Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Stomatology Hospital Affiliated to Zhejiang University of Medicine, Hangzhou 310000, China)

Objective This work aims to examine the effects of paeonol treatment on the ability of bone marrow-derived macrophage (BMM) to excrete inflammatory factors and to differentiate into osteoclasts upon induction with Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis). This work also aims to investigate the underlying mechanisms of these abilities.MethodsBMM culture was treated with different paeonol concentrations at for 1 h and then stimulated with P. gingivalis for 24 h before programmed death-ligand 1 (PD-L1) was quantified with flow cytometry. Tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β, and IL-6 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The BMM culture was treated with the receptor activator for nuclear factor-κB ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), and then with paeonol for 1 h prior to induction with P. gingivalis. Then, osteoclast formation was assessed using tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) staining. The osteoclast-relatedproteins TRAP and receptor activator of nuclear factor-κB (RANK) were quantified by Western blotting.ResultsPaeonol was nontoxic to BMM within a range of 10–50 μmol·L-1. Flow cytometry showed that paeonol inhibited PD-L1 expression inP. gingivalis-induced BMM in a dose-dependent manner. ELISA indicated that paeonol dose-dependently inhibited the excretion of TNF-α, IL-1β, and IL-6 by P.gingivalis-inducedBMM (P＜0.01). TRAP staining revealed that paenol treatment inhibited the differentiation of P.gingivalis-induced BMM into osteoclasts. Western blot results suggested that paeonol decreased the expression of TRAP and RANK in BMM.ConclusionPaeonol dose-dependently inhibited the excretion of the inflammatory factors TNF-α, IL-1β, and IL-6 by P. gingivalis-induced BMM in a dose-dependent manner. Moreover, paenol treatment prevented the differentiation of P. gingivalis-induced BMM differentiation into osteoclasts.

paeonol;Porphyromonas gingivalis; bone marrow-derived macrophage; osteoclast; inflammatory; differentiation

R 781.4

A

10.7518/hxkq.2017.02.006

Supported by: Innovative Talents Program of Guiyang City [(2012HK)209-50]; Special Project of Talent Cultivation in the Western Region [(2013)5044]. Correspondence: Su Lingkai, E-mail: 258512692@qq.com.

2016-05-12；

2017-01-18

貴陽市高層次創新型青年科技人才培養計劃[筑教發（2-012HK）209-50號]；西部地區人才培養出國特別項目[（2013）5044號]

陳筑，副主任醫師，博士，E-mail：17784810646@163. com

宿凌愷，住院醫師，博士，E-mail：258512692@qq.com