針刺對腦梗死大鼠骨骼肌ATP酶及血清CK、LDH活性的影響

張懿+施靜+馮斯峰+劉梅芳+陳致宏+杜福生

摘要：目的從骨骼肌損傷標志酶的活性改變?nèi)胧郑接戓槾虒δX梗死后骨骼肌運動功能的改善作用，以進一步揭示其作用機制。方法健康雄性SD大鼠100只，體重（192±9）g，隨機分為頭針組、體針組、頭針+體針組，模型組和空白組。每組20只。采用線栓法制作大鼠大腦中動脈局灶性腦梗死模型，并應(yīng)用Zea-Longa的5級評分標準對造模大鼠進行篩選。每組分別于針刺治療后即刻、24 h、48 h股動脈取血離心，檢測ATP酶、CK、LDH活性。結(jié)果①模型組ATP酶活性在0h明顯低于空白組（P<0.001），并與24h至48h之間回升；與模型組相比，頭針加體針治療組在0h（P<0.001），24h（P<0.01），48（P<0.05）小時差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，體針組在24h有顯著性差異（P<0.001），增加ATP酶活性的作用達到峰值；頭針組在0h差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。②模型組CK活性在48h明顯高于空白組（P<0.001）；與模型組相比，三個針刺組中CK含量有明顯變化，頭針加體針治療組在0h（P<0.05），24h（P<0.05），48h（P<0.01）差異均具有可比性；體針組在0h，48h有顯著性差異（P<0.01）；頭針組在24h有顯著性差異（P<0.05）③模型組CK活性在0h、12h、48h均明顯高于空白組（P<0.001）；與模型組比較，三個針刺組中LDH含量均有明顯變化，頭針加體針治療組在0h（P<0.01）、24h（P<0.05）均具有可比性，體針組在48h有顯著性差異（P<0.01），頭針組在0h有顯著性差異（P<0.01）。④頭針+體針組與體針組在改變ATP、CK、LDH含量的變化方面無顯著差異（P>0.05）。結(jié)論針刺可以增加ATP酶活性，降低血清CK及LDH活性，提高骨骼肌有氧酵解，增加肌細胞膜通透性，減輕骨骼肌損傷。

關(guān)鍵詞：針刺；腦缺血；大鼠；骨骼肌；ATP酶、CK、LDH活性

中圖分類號：R255.2文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2017）04-0087-04Effects of Acupuncture on ATPase and Serum CK and LDH Activity

in Skeletal Muscle of Rats with Cerebral Infarction

ZHANG Yi1， SHI Jing2， FENG Si-feng2， LIU Mei-fang2， CHEN Zhi-hong2， DU Fu-sheng1

（1. Yunnan Uinversity of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， Yunnan；

2. Yunnan Traditional Chinese Medicine Hospital， Kunming 650021， Yunnan）

【Abstract】Objective： To study the effect of acupuncture on skeletal muscle motor function after cerebral infarction， and to reveal its mechanism from the changes of skeletal muscle injury marker enzyme activity. Methods： 100 healthy male SD rats weighing 192±9 g were randomly divided into a scalp acupuncture group， a body acupuncture group， a scalp + body acupuncture group， a model group and a blank group， 20 rats per group. The suture method was used to establish rat models of focal cerebral infarction and Zea-Longa's five-level scoring standard was used to screen the model rats. The activity of ATPase， CK and LDH of each group were measured by centrifugation at 24 h and 48 h after acupuncture treatment. Results： 1. The activity of ATPase in the model group was significantly lower than that in the blank group （P<0.001） at 0h， and recovered from 24h to 48h. Compared with the model group， the scalp acupuncture group showed significant differences at 0h （P<0.001）， 24h（P<0.01）， and at 48h （P<0.05）. The body acupuncture showed the significant difference at 24h（P<0.001）and the effect of increasing activity of ATPase reached the peak. The scalp acupuncture group showed the difference was statistically significant. 2. CK activity in the model group was significantly higher than that in blank group at 48h （P<0.001）. Compared with model group， CK contents in three acupuncture groups significantly changed at 0h （P<0.05）， 24h （P<0.05） and 48h （P<0.01）.The differences were comparable. The body acupuncture group had significant difference at 0h and 48h （P<0.01）. The scalp acupuncture had significant difference at 24h （P<0.05）. 3. CK activity in the model group was significantly higher than that in the control group （P<0.001） ， at 0h， 12h and 48h. Compared with the model group， the levels of LDH in the three acupuncture groups significantly changed. The difference of the scalp + body acupuncture group was comparable， at 0h （P<0.01） and 24h （P<0.05）. The body acupuncture group had significant difference at 48h （P<0.01）. And the scalp acupuncture group had significant difference at 0h （P<0.01）. 4. The scalp + body acupuncture group had no significant difference in the changes of ATP， CK and LDH contents （P>0.05）. Conclusion： Acupuncture can increase the activity of ATPase， decrease the activity of serum CK and LDH， improve the aerobic glycolysis of skeletal muscle， increase the permeability of muscle membrane and reduce skeletal muscle injury.

【Key words】acupuncture， cerebral ischemia， rat， skeletal muscle. ATPase， CK， activity of LDH

腦梗死具有極高的致殘率，超過2/3的腦梗死患者伴有肢體功能障礙[1～2]，主要包括骨骼肌無力、關(guān)節(jié)攣縮以及肌肉萎縮等。骨骼肌的繼發(fā)性損傷是導(dǎo)致肢體功能障礙的主要原因之一，現(xiàn)代研究表明腦梗死后4 h即可以觀察到患側(cè)骨骼肌適應(yīng)性的改變[3]，從而導(dǎo)致肌肉運動模式的改變，引起肢體功能障礙[4]。針刺作為一門傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，治療腦梗死后肢體功能障礙療效顯著[5-6]，近年來，已應(yīng)用多種客觀指標觀察針刺對腦梗死的恢復(fù)作用，如血液流變[7]、免疫機制[8]、神經(jīng)保護因子等[9]，但針刺對腦梗死后骨骼肌的恢復(fù)作用的研究尚不多見。課題組前期開展多中心、大樣本研究已證實針刺可有效促進腦梗死患者骨骼肌功能的恢復(fù)。也有研究證明穴位電刺激可改變大鼠骨骼肌ATP酶、CPK、LDH，并可改變骨骼肌細胞胞漿內(nèi)游離鈣濃度，對肌肉快速收縮和舒張產(chǎn)生積極效果[10～11]。為進一步探索針刺對腦梗死大鼠骨骼肌損傷后的改善作用機制，本試驗基于能量代謝的基礎(chǔ)上，觀察不同針刺時間對骨骼肌ATP酶、CK、LDH活性的變化的影響。

1材料與方法

1.1試驗材料2月齡健康雄性SD大鼠100只，體重（192±9）g，購于昆明動物研究所實驗動物中心（實驗動物許可證號SCXK2010-0006）。實驗室溫度（24±2）℃，濕度（50±5）%，光照時間8：00-20：00，自由飲水和進食，普通大鼠飼料購于昆明動物研究所實驗動物中心。術(shù)前12h禁食。

1.2腦梗死模型的建立以10%水合氯醛（4 mL/kg）注射于大鼠腹腔內(nèi)進行麻醉，均保留自主呼吸。麻醉后采用腔內(nèi)線栓法制備大鼠左側(cè)中動脈局灶性腦梗死模型。大鼠仰臥固定于手術(shù)臺，常規(guī)頸部備皮，于頸部正中偏左側(cè)切口，逐層分離右側(cè)的頸總、頸內(nèi)及頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈，并于頸總動脈近心端及 “V”型分叉處放置動脈夾，將尼龍線末端點涂石蠟形成光滑線頭，置入兩動脈夾之間，長度約18 mm，直至稍遇阻滯感停止進線，結(jié)扎線栓及頸總動脈，以防止出血和線栓脫落，放開動脈夾，縫合皮膚。

1.3模型納入排除標準參照Zea-Longa的5級評分標準對造模大鼠進行篩選[12]，0分提示未見神經(jīng)病學(xué)征象；1分提示輕度局灶性神經(jīng)功能缺失，大鼠被提尾懸空時病灶對側(cè)前肢呈屈曲、抬高狀等；2分提示中度局灶性神經(jīng)功能缺失，出現(xiàn)向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)征象；3分提示重度局灶性神經(jīng)功能缺失，有向癱瘓側(cè)跌倒征象；4分提示無自發(fā)活動及意識水平下降。評分在1-3分為造模成功。以下兩種情況為造模失敗，予以剔除：①實驗過程中大鼠死亡。②規(guī)定時間處死動物時見有蛛網(wǎng)膜下腔出血或頸內(nèi)動脈分叉部出血。

1.4實驗分組蘇醒后大鼠按照上述方法進行評分，參加試驗大鼠共100只，模型制備過程中死亡6只，造模失敗9只，最終1-3分共85只大鼠納入試驗。按照數(shù)字隨機表法分為頭針組、體針組、頭針+體針組，模型組和空白組。每組17只。組間動物體重均無顯著性差異。

1.5針刺干預(yù)方案大鼠取穴的定位及針刺手法均參照華興邦等研制的《大鼠穴位圖譜》。頭針組：針刺大鼠的頭穴：百會、風(fēng)府，留針5 min，每日1次；體針組：針刺大鼠后會、環(huán)跳、前三里、陽陵泉、后三里，留針5 min，每日1次；頭針+體針組：針刺大鼠的百會、風(fēng)府、后會、環(huán)跳、前三里、陽陵泉、后三里，留針5 min，每日1次；模型組：造模后不施加任何刺激；空白組：空白對照不造模，正常喂養(yǎng)

1.6標本采集及指標檢測分別于每組針刺即刻、24 h、48 h于大鼠腹主動脈取血，采用南京建成生物工程研究所提供的ATP酶（產(chǎn)品貨號A016-2）、CK（產(chǎn)品貨號A032）、LDH（產(chǎn)品貨號A020-2）試劑盒和帝肯酶標儀（型號：Sunrise RC TS TC，產(chǎn)地：奧地利）進行檢測，具體檢測過程嚴格按照說明書進行。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法報告中所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較選擇LSD 法，以P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1針刺不同時刻對大鼠ATP酶活性的影響由表1、圖1可以看出，與模型組相比，頭針加體針治療組在0、24、48 h差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，體針組在24 h有顯著性差異（P<0.001），增加ATP酶活性的作用達到峰值；頭針組在0h差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2針刺不同時刻對大鼠CK活性的影響由表2、圖2可以看出，模型組CK活性在48h明顯高于空白組（P<0.001）；頭針加體針治療組在0、24、48 h差異均具有可比性；體針組在0 h，48 h有顯著性差異（P<0.01）；頭針組在24 h有顯著性差異（P<0.05）

2.3針刺不同時刻對大鼠LDH活性的影響由表3、圖3可以看出，模型組CK活性在0h、12h、48h均明顯高于空白組（P<0.001）；頭針加體針治療組在0h（P<0.01）、24h（P<0.05）均具有可比性，體針組在48h有顯著性差異（P<0.01），頭針組在0h有顯著性差異（P<0.01）

3討論

腦梗死后患者多伴有骨骼肌萎縮失用，許多研究表明骨骼肌出現(xiàn)病理性變化是腦梗死后肢體殘疾的重要原因[13]，而能量代謝與骨骼肌功能的正發(fā)揮有著密切的關(guān)系。大量研究證實，針灸對腦梗死后的骨骼肌萎縮產(chǎn)生良性調(diào)節(jié)作用。

ATP酶是影響肌肉收縮張力和收縮速率的重要因素，是判斷肌肉收縮能力的重要生化指標[14～17]。乳酸脫氫酶（LDH）是糖原無氧酵解的關(guān)鍵酶之一，能保證肌肉在短暫缺氧時仍能獲得ATP，評價骨骼肌受損情況。肌酸激酶CK在骨骼肌中含量最多，當肌細胞膜受損時，血液中CK含量明顯升高，因此，通過針刺干預(yù)肌肉內(nèi)能量的轉(zhuǎn)化可判斷損傷骨骼肌的恢復(fù)狀態(tài)[18～19]。本試驗結(jié)果認為①造模成功后，機體處于缺氧狀態(tài)，骨骼肌線粒體氧化磷酸化功能受損，ATP酶生成減少，活性顯著降低。當針刺介入后ATP酶含量出現(xiàn)增高趨勢，其中頭針+體針組在針刺即刻療效最為顯著，48h后ATP酶含量已與正常水平無差異。體針組ATP酶含量呈先增高后降低的態(tài)勢，于24h異常增高，超出正常水平。②大鼠腦梗死后0h即出現(xiàn)血清LDH活性的增高。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是腦梗死后缺氧狀態(tài)下骨骼肌細胞內(nèi)離子代謝紊亂，大量自由基生成造成細胞膜通透性改變，此時LDH通過細胞膜進入血液中，造成血液中LDH含量的異常增高。還可能是因為腦梗死缺氧狀態(tài)下骨骼肌中ATP酶活性顯著降低，吸收和代謝過程受阻，有氧化受阻，無氧酵解活躍，與進行無氧酵解相關(guān)的LDH的活性相應(yīng)地升高，使其在肌肉的能量代謝過程中發(fā)揮重要作用，這是機體的一種代償性反應(yīng)。③血清CK在腦梗死24h之后出現(xiàn)大幅度增高，可能在48h達到峰值。其變化與LDH類似但并不一致，均可能與細胞膜的損害有關(guān)。針刺介入后，頭針+體針組于即刻短暫升高后逐漸降低，但48h后仍沒有達到正常水平，CK活性的變化與LDH兩者之間的關(guān)系仍需要進一步試驗支持。研究結(jié)果表明頭針和體針穴位均對肌細胞膜有保護作用，其機制可能是，頭針和體針穴位可以清除機體內(nèi)的過剩自由基，提高有氧酵解，維從而持細胞膜Na+、K+的穩(wěn)定轉(zhuǎn)運，減少對肌細胞膜的傷害，保持細胞膜的良好通透性，從而減少血液中LDH、CK流出，從而改善骨骼肌微血管機能狀態(tài)，保護骨骼肌，最終達到了恢復(fù)腦梗死后骨骼肌運動能力的目的。

通過動物實驗證明，大鼠腦梗死骨骼肌損傷后，頭針+體針組在改善ATP酶及血清CK及LDH活性方面療效較為穩(wěn)定，可以提高骨骼肌有氧酵解，增加肌細胞膜通透性，減輕骨骼肌損傷，在臨床實驗中，針刺是否會對腦梗死后骨骼肌的能量代謝產(chǎn)生上述影響以及其中的作用機制仍有待進一步研究。

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