Afp-cre-lacZ轉基因小鼠的構建

顧曉雯, 孫瑞林, 費 儉

(1. 同濟大學生命科學與技術學院, 上海 200092; 2. 上海南方模式生物科技股份有限公司, 上海 201203)

Afp-cre-lacZ轉基因小鼠的構建

顧曉雯1, 孫瑞林2, 費 儉1

(1. 同濟大學生命科學與技術學院, 上海 200092; 2. 上海南方模式生物科技股份有限公司, 上海 201203)

目的 研究甲胎蛋白(Afp)陽性細胞的增殖分化在組織生長修復，腫瘤發生過程中的作用，建立Afp-CreERT轉基因小鼠細胞示蹤系統。方法 采用DNA雄原核顯微注射方法獲得Afp-CreERT轉基因小鼠，篩選出合適的品系后，使之與Rosa26-lacZ工具小鼠雜交，獲得Cre/lacZ雙陽性的Afp-cre-lacZ轉基因小鼠。結果 顯微注射后，共出生小鼠56只，經PCR鑒定Cre陽性小鼠共4只，陽性小鼠傳代后各為一系。篩選內源性Afp表達與Cre表達相對符合的品系作為Afp-CreERT轉基因小鼠品系建系。Afp-CreERT轉基因小鼠與Rosa26-lacZ工具小鼠雜交，經PCR鑒定后獲得Cre/lacZ雙陽性的Afp-cre-lacZ轉基因小鼠。經實時PCR，X-gal染色，免疫熒光染色鑒定后得到Afp-cre-lacZ轉基因小鼠細胞示蹤系統，同時證實該系統能夠正確示蹤Afp表達陽性的細胞，同時也能夠應用于肝損傷小鼠模型中。 結論 成功構建了Afp-cre-lacZ轉基因小鼠細胞示蹤系統，為研究這類細胞的譜系發生提供了工具。

甲胎蛋白(Afp); 轉基因小鼠模型; 細胞示蹤

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, Afp)是由Afp基因編碼的一種糖蛋白，屬于血清白蛋白一類的蛋白家族。該蛋白于1956年自人類胚胎中首次被發現[1]。在胚胎發育過程中，Afp基因開放表達，并且合成具有重要功能的Afp[2]。但隨著發育完成，Afp的表達量逐漸降低，出生2年后，血清中基本已經檢測不到Afp[3,4]。成年以后的Afp的高表達往往與腫瘤密切相關[5]。在對肝臟腫瘤的臨床診斷中，血清中Afp的含量甚至成為了一項重要指標[6,7]。在生物學方面，有研究[8]指出Afp基因的表達與肝癌細胞的增殖相關，是一種促癌基因。還有研究[9]顯示，在一些肝癌細胞中，Afp基因的表達甚至與表觀調控有關。由此可見，Afp與細胞的發育、增殖密切相關，針對其作用與機制的研究多有報道。然而從細胞角度來說，以Afp為細胞表面標記，針對Afp表達陽性的細胞類群的研究并不多見。在正常的成體組織器官中，是否還有Afp陽性細胞？如果有，那么這些細胞與胚胎期的Afp陽性細胞有何關聯？在組織發育、損傷修復甚至是腫瘤形成的過程究竟扮演怎樣的角色？這些問題目前還不明了。為了研究表達Afp表達陽性的這類細胞的功能，本文利用CreERT-loxP系統建立了以Afp基因表達為標志的小鼠細胞譜系活體模型，并在肝臟中，驗證了這一模型的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性C57BL/6J小鼠, 8～12周齡，上海南方模式生物科技股份有限公司提供[SCXK(滬)2014-0002]，所有動物實驗均在上海南方模式生物研究中心完成[SYXK(滬)2013-0035]。動物實驗方案獲得公司動物倫理委員會的批準。

1.2 試劑和實驗儀器

PCR試劑盒 Taq PCR MasterMix、反轉錄試劑盒FastQuant RT Super Mix、Realtime PCR試劑盒SuperReal PreMix Plus SYBR Green、TRiZol購自北京Tiangen公司，GenenRuler1 kb DNA Ladder購自美國MBI Fermentas公司，他莫昔芬、玉米油、Nuclear Fast Red染料、硫酸鋁鉀十二水合物、六氰基亞鐵酸鉀三水合物、鐵氰化鉀、氯化鎂六水合物、N,N-二甲基甲酰胺、IGEPAL、戊二醛、多聚甲醛購自美國Sigma公司，anti-lacZ、anti-AFP一抗、山羊抗雞(goat Anti-Chicken) IgY H&L (Cy3)購自美國Abcam公司，山羊抗兔(goat anti-rabbit)(FITC) 二抗購自上海碧云天公司、其他常規化學試劑購自中國國藥集團化學試劑有限公司。PCR 儀和Real-time PCR儀購自德國Eppendorf公司，光學顯微鏡90i購自日本Nikon公司，共聚焦顯微鏡Fv10i購自日本Olympus公司，冰凍切片機購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組鑒定 小鼠基因組提取: 小鼠出生后2周內, 剪取長約0.3 cm左右的鼠尾。加入400 μL裂解液(包含質量分數10% SDS、1 mol/L Tris、0.5 mol/L EDTA、5 mol/L NaCl以及40 μL蛋白酶K (10 mg/mL))。置于56 ℃雜交爐內, 消化過夜。離心取上清, 加入800 μL無水乙醇沉淀，沉淀用體積分數75%乙醇洗滌1次, 稍晾干后溶解于100 μL ddH2O中，4 ℃溶解過夜。獲得小鼠基因組DNA。

PCR鑒定: 利用PCR試劑盒 Taq PCR MasterMix擴增鑒定片段, 反應體系參見說明書。反應條件為: 94 ℃預變性3 min; 94 ℃變性20 s, 58 ℃退火30 s，72 ℃延長30 s, 變性至延長步驟共35個循環, 72 ℃延長10 min。PCR產物質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

引物序列:

1.3.2 實時定量PCR檢測 小鼠頸椎脫臼處死之后取心、肝、脾、肺、腎和骨髓組織提取RNA。使用反轉錄試劑盒FastQuant RT Super Mix翻轉成cDNA模板。使用Realtime PCR試劑盒SuperReal PreMix Plus SYBR Green檢測RNA表達情況。

引物序列:

1.3.3 他莫昔芬誘導表達 配制20 mg/mL他莫昔芬/玉米油溶液；按小鼠體質量120 mg/kg劑量，隔日、腹腔注射給藥，共給藥5次，給藥2周后進行后續實驗。

1.3.4 組織標本處理以及冰凍切片 取小鼠肝臟組織，質量分數4%多聚甲醛4 ℃固定4 h，換質量分數15%蔗糖脫水過夜，換質量分數30%蔗糖脫水8 h，冰凍切片包埋劑(OCT)包埋組織后切片。切片厚度10 μm。

1.3.5 X-gal染色 取冰凍切片, 置于冰上, 2 mmol/L MgCl2/PBS洗2次，每次5 min，去除OCT。配置洗滌溶液(含質量分數0.02% NP-40以及2 mmol/L MgCl2)洗滌切片，后將切片置于X-gal染液，37℃染色過夜。次日，復染核快紅，常規梯度脫水，透明后樹脂封片，光學顯微鏡下觀察。

1.3.6 免疫熒光染色 冰凍切片37 ℃復溫30 min后，60 ℃烘箱烘干; 體積分數0.5%Triton/PBS洗2～3次，免疫組織化學封閉液封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，加入二抗以及DAPI常溫孵育1 h，PBS洗3次后封片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.7 肝損傷模型 參考2-乙酰氨基芴(2-Acetylaminofluorene, 2-AAF)給藥輔以肝部分切除(Partial Hepatectomy，PH)手術聯用的方法[10,11], 作者制作了小鼠肝損傷模型。具體實驗方案為，10 mg/kg 2-AAF灌胃給藥, 連續給藥4 d; 第5日進行肝切除手術; 第6日, 第8日以120 mg/kg的劑量, 灌胃給他莫昔芬，共2次; 同時，手術后繼續以10 mg/kg 2-AAF的劑量灌胃給藥，每日一次，7 d后取小鼠肝臟組織，進行檢測。

2 結果

2.1 Afp-CreERT轉基因小鼠獲得

轉基因小鼠制備方式為小鼠受精卵細胞原核DNA顯微注射。AFP質粒DNA(上海南方模式生物科技股份有限公司提供)用SacII酶切，凝膠回收酶切大片段(約24 kb)后進行小鼠受精卵細胞原核DNA顯微注射(圖1A、B)。顯微注射出生56只小鼠于2周齡剪尾，抽提基因組DNA，經PCR, 篩選發現4只轉基因陽性小鼠(圖1C)。陽性小鼠和數只野生型小鼠再次剪尾抽提基因組DNA，雙盲再次進行PCR檢測，確認4只為轉基因陽性小鼠，并作為首建者小鼠，其后代單獨建系，即獲得4個品系的待篩選Afp-CreERT轉基因小鼠。

2.2 Afp-CreERT轉基因小鼠Cre表達情況檢測將4只首建者小鼠與野生型小鼠進行傳代建系，取后代小鼠，檢測其Cre表達情況，表明其中2系小鼠的Cre的RNA表達為陰性，故予以淘汰。另外2系小鼠中選擇表達情況與內源Afp基因(e-Afp)表達譜更為接近的1系小鼠繼續繁殖，作為Afp-CreERT轉基因小鼠進行保留，另1系小鼠則淘汰(圖1D)。

2.3 Afp-cre-lacZ轉基因小鼠X-gal染色鑒定

將Afp-creERT轉基因小鼠與Rosa26-lacZ工具小鼠雜交，獲得Cre/lacZ雙陽性的Afp-cre-lacZ品系的細胞示蹤小鼠。取1月齡Afp-cre-lacZ品系小鼠，給予他莫昔芬誘導之后取其肝臟組織，進行X-gal染色鑒定。經過他莫昔芬誘導后，X-gal染色陽性細胞出現在肝臟內(圖2)。

圖 1 Afp-CreERT轉基因小鼠品系鑒定Figure 1 Identification of Afp-CreERT transgenic mice

圖 2 Afp-cre-lacZ轉基因小鼠肝臟組織X-gal染色結果Figure 2 X-gal staining results of Afp-cre-lacZ mice liver

2.4 Afp-cre-lacZ轉基因小鼠免疫熒光染色鑒定

為了檢驗肝臟X-gal染色陽性的細胞是否為Afp陽性細胞, 利用Afp以及lacZ抗體進行免疫熒光共定位的檢測。檢測結果顯示，Afp與lacZ能夠共定位(圖3)。因此，Afp-cre-lacZ轉基因小鼠示蹤系統中, lacZ陽性細胞的確也是Afp陽性細胞。

2.5 Afp-cre-lacZ轉基因小鼠在肝損傷模型中應用

圖 3 Afp-cre-lacZ轉基因小鼠肝臟組織中Afp與lacZ免疫熒光共定位Figure 3 Immunofluorescence co-localization of Afp and lacZ in Afp-cre-lacZ mice liver

為了鑒定Afp-cre-lacZ轉基因小鼠在肝損傷或者疾病模型中是否也能夠進行應用, 建立了2/3肝切除手術聯合2-AAF給藥的肝損傷模型。X-gal染色結果顯示，在肝切除手術的傷口處，出現了X-gal染色陽性的細胞(圖4)。表明Afp-cre-lacZ轉基因小鼠示蹤系統可以應用于肝損傷模型。

3 討論

本文利用傳統的DNA雄原核顯微注射方法構建了Afp-cre-lacZ轉基因小鼠。小鼠肝組織切片的X-gal染色與免疫熒光共定位的結果表明，在肝臟中，Afp-cre-lacZ轉基因小鼠示蹤系統能夠正確示蹤Afp表達陽性的細胞，同時也能夠應用于肝損傷小鼠模型中。另外，實驗結果也表明，在成體肝組織中，存在少量Afp表達陽性細胞。

近年來，對肝臟細胞的示蹤研究報道[12-15]主要集中在干細胞、實質細胞以及膽管細胞的研究，并且對其增殖分化已經有了比較深入了解。由于Afp與胚胎發育以及腫瘤發生存在密切關聯[16]，因此，在正常組織中Afp陽性細胞可能與干細胞相關，在肝癌中，則可能與腫瘤細胞相關。但是在胚胎、成年和疾病這3個時期, Afp陽性細胞之間的關聯仍未知, 缺乏合適的動物模型是一個重要的原因。因此, 作者認為利用本文所構建的Afp-cre-lacZ轉基因小鼠模型將有助于對Afp陽性細胞在生理和病理情況下的作用開展深入研究。

圖 4 Afp-cre-lacZ轉基因小鼠肝損傷模型X-gal染色結果Figure 4 X-gal staining result in 2-AAF/PH liver injury of Afp-cre-lacZ mice

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Construction of Afp-cre-lacZ Transgenic Mouse Model

GU Xiao-wen1, SUN Rei-lin2, FEI Jian1
(1. School of Life Science and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, China 2. Shanghai Biomodel Organism Science & Technology Development Co.,Ltd., Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo study the function of alpha-fetoprotein (Afp) positive cells during tissues growth and repair or in tumorigenesis, Afp-cre-lacZ linage tracing mouse model was established.MethodsAfp-CreERT mice were established by microinjection and identified by real time PCR. Afp-CreERT mice were crossed with Rosa26-lacZ mice. Cre/lacZ both positive mice were kept as Afp-crelacZ mice.ResultsFifty-six transgenic mice were born after microinjection. Four of them genotyped Cre positive were kept as founder. Each founder was established a strain. Cre expression of each strain was identified via real time PCR. Thus Afp-CreERT transgenic mouse was established. The Cre/lacZ both positive offspring of Afp-CreERT mice were crossed with Rosa26-lacZ mice were kept as Afp-crelacZ mice. Identified by real time PCR, X-gal staining and immunofluorescence, Afp-cre-lacZ mice were observed that they could be used in lineage tracing and further studies.Conclusions The Afp-cre-lacZ mice established may be used as a tool for lineage tracing studies.

Alpha-fetoprotein (Afp); Transgenic mouse model; Lineage tracing

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0089-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.002

2017-02-05

國家重點基礎研究發展計劃(2010CB945501)

顧曉雯(1988-), 女, 博士, 從事生物化學與分子生物學研究。E-mail: 17guxiaowen@tongji.edu.cn

費 儉, 教授。E-mail: jfei@tongji.edu.cn