紫杉醇緩釋微球對卵巢癌裸小鼠原位移植瘤的抑瘤效果

饒子亮, 王 弋, 王 諾, 熊仁清, 張明浩, 鄺少松, 唐小江

(1. 廣東省醫學實驗動物中心, 佛山528248; 2. 天大藥業(珠海)有限公司, 珠海519070)

紫杉醇緩釋微球對卵巢癌裸小鼠原位移植瘤的抑瘤效果

饒子亮1, 王 弋1, 王 諾1, 熊仁清2, 張明浩2, 鄺少松1, 唐小江1

(1. 廣東省醫學實驗動物中心, 佛山528248; 2. 天大藥業(珠海)有限公司, 珠海519070)

目的 研究以新型聚乳酸磷酸酯聚合物(PLCE)為載體的紫杉醇緩釋微球體內抑瘤效果。方法 采用HO8910人卵巢癌細胞株，手術接種于68只BALB/c裸小鼠卵巢包膜下。3周后，取腫塊大小相對均勻的42只裸小鼠隨機分成7組: 空白對照組、聚合物空白微球對照組、紫杉醇注射液組，紫杉醇緩釋微球1中、低劑量組，紫杉醇緩釋微球2中、低劑量組，每組6只。分組當日給藥1次，連續觀察一個月。結果 紫杉醇注射液抑瘤率57.0%; 紫杉醇緩釋微球2中劑量抑瘤率77.1%，低劑量抑瘤率58.7%。結論 以新型PLCE為載體的紫杉醇緩釋微球2(60 mg/kg)對卵巢癌裸小鼠原位移植瘤有良好的抑制效果，但是毒性仍然較大，需要進一步改進。

紫杉醇; 微球; 卵巢癌; 聚乳酸磷酸酯共聚物(PLCE)

紫杉醇是從紅豆杉樹(Taxaceae)的樹皮中分離出的一種化療藥物[1]，能誘導和促進微管蛋白聚合和組裝, 從而阻止腫瘤細胞繁殖，是目前臨床治療公認的有效一線化療藥物[2]。然而，其應用的最大問題是不溶于水，臨床上常用的紫杉醇針劑靠表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油與脫水乙醇以1∶1的混合液溶解，該溶劑副作用大[3], 易引起嚴重的過敏反應。同時由于靜脈給藥, 時程長(連續24 h滴注)，患者用藥不便且使用受限。

以微型成球技術制備的微球作為藥物遞送系統具備了靶向給藥、多種途徑給藥和緩釋或控釋藥物等優點。在制備微球所用的載體材料中，可生物降解的合成高分子材料受到普遍重視并得到廣泛應用[4]。本實驗采用新型聚乳酸磷酸酯共聚物(PLCE)緩釋微球, 并觀察其應用于紫杉醇的體內抑瘤效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與飼養條件

6～7周齡雌性SPF級BALB/c裸小鼠76只, 由廣東省醫學實驗動物中心提供[SCXK(粵)2013-0002]。飼養在廣東省醫學實驗動物中心SPF級實驗動物室IVC系統內[SYXK(粵)2013-0002], 室內保持20～26 ℃,相對濕度40%～70%，自由飲食， 飼料由廣東省醫學實驗動物中心生產[SCXK(粵)2013-0002]。實驗方案經廣東省醫學實驗動物中心實驗動物倫理委員會審查通過。

1.2 細胞

HO8910人卵巢癌細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.3 主要試劑和儀器

主要儀器: CKX41型倒置顯微鏡, 日本Olympus公司; 311型恒溫CO2孵箱，美國Thermo公司; SWCJ-2FD型超凈工作臺, 蘇州凈化有限公司; HWS-28型恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司; MS 3 digital型振蕩器，德國IKA公司; KDC-2046型低速冷凍離心機，科大創新股份有限公司中佳分公司。

主要試劑: DMEM培養液, 美國Gibco公司; 胎牛血清, 美國Hyclone公司; 青/鏈霉素雙抗, 杭州吉諾生物醫藥有限公司; 胰酶, 杭州吉諾生物醫藥有限公司; PBS, 杭州吉諾生物醫藥有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 微球制備 紫杉醇緩釋微球的制備工藝見圖1,白色粉末, 成球形良好(圖2)。紫杉醇緩釋微球1，批號T130717，收率88.4%, 包封率90.7%, 顆粒直徑14～76 μm; 紫杉醇緩釋微球2, 批號T130822, 收率80.3%, 包封率99.1%, 顆粒直徑14～76 μm。

1.4.2 接種 選用對數生長期的HO8910人卵巢癌細胞，經胰酶消化后，用DMEM培養基配成1× 107個/mL濃度的細胞懸液, 取裸小鼠8只, 注射于裸小鼠皮下0.2 mL/只。待皮下腫瘤直徑達到1 cm時處死裸小鼠(約3周)，切下瘤塊除去壞死部分選用淡黃色或呈魚肉狀瘤組織置于生理鹽水中剪成直徑約為1 mm3的瘤塊備用。68只裸小鼠戊巴比妥(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，待裸小鼠麻醉后固定于操作板上，背部皮膚酒精消毒備皮，從左側肋脊角下逐層切開背部皮膚、腹膜，進入腹腔，將卵巢掏出腹腔，用縫合線將大小為 1 mm3的移植瘤組織縫合至卵巢包膜下，操作結束后將卵巢送回腹腔，無菌絲線縫合腹膜和皮膚。

圖 1 紫杉醇緩釋微球制備工藝圖

圖 2 紫杉醇緩釋微球形態電鏡圖

1.4.3 分組 3周后取腫塊大小相對均勻的42只裸小鼠隨機分成7組: 空白對照組、聚合物空白微球對照組(劑量為3 g/kg)、紫杉醇注射液組(劑量為50 mg/kg), 紫杉醇緩釋微球1中、低劑量組(劑量分別為120 mg/kg、60 mg/kg), 紫杉醇緩釋微球2中、低劑量組(劑量分別為120 mg/kg、60 mg/kg)，每組6只。

1.4.4 給藥 聚合物空白微球對照組裸小鼠腹腔注射150 mg/mL輔料微球注射液，紫杉醇注射液組裸小鼠腹腔注射2.5 mg/mL紫杉醇注射液，紫杉醇緩釋微球1、2中、低劑量組裸小鼠分別腹腔注射6 mg/mL、3 mg/mL紫杉醇緩釋微球注射液, 注射量為0.2 mL/10 g體質量，分組當日給藥1次，每日觀察1次，連續觀察一個月。

1.4.5 觀測指標 每日 1次觀察裸小鼠精神狀態、活動力、反應、大小便形態、有無腹水產生、有無腹瀉等；每周測量2次動物體質量; 實驗結束時，取出腫瘤完整剝離后測量腫瘤體積(V=1/ 2ab2，a、b分別為最長和最短的兩個直徑)，并稱重腫瘤，計算腫瘤抑制率(%):

1.5 數據處理

2 結果

2.1 一般情況觀察和體質量

紫杉醇注射液組和紫杉醇緩釋微球組給藥初期動物出現匍匐行走、精神萎靡、明顯消瘦等癥狀，大便無稀爛。紫杉醇緩釋微球組1、2中、低劑量組均有死亡。其他各組存活小鼠平均體質量均有所增加, 但組間無顯著性差異(P＞0.05)(表1)。

2.2 腫瘤體積和瘤重

輔料微球組腫瘤體積、瘤重與空白對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。與空白對照組比較，紫杉醇注射液組、紫杉醇緩釋微球2低劑量組、中劑量組的腫瘤體積、瘤重顯著降低(P＜0.05)(表1)。

2.3 抑瘤率

紫杉醇注射液抑瘤率57.0%; 紫杉醇緩釋微球2中劑量抑瘤率77.1%, 低劑量抑瘤率58.7%; 與空白對照組比較, 紫杉醇注射液組、紫杉醇緩釋微球2低劑量組、紫杉醇緩釋微球2中劑量組腫瘤重量顯著降低(P＜0.05); 與紫杉醇注射液組比較, 紫杉醇緩釋微球2中劑量組腫瘤重量顯著降低(P＜0.05)(表1)。

3 討論

紫杉醇是目前臨床公認的卵巢癌一線化療藥物[5-9]。關于紫杉醇誘導腫瘤細胞凋亡的機制，普遍認為與其擾亂細胞微管系統有關。該藥物導致有絲分裂停滯在G2 /M期，且隨藥物作用時間延長而阻滯作用增強[10]，短時間內藥物代謝完畢, 給藥期間不能對腫瘤進行持續殺傷作用。另外, 紫杉醇在水中的溶解度約為0.25 μg/mL, 因而其體內有效利用率較低, 因此紫杉醇的有效治療量(135 mg /m2) 相對較大，而高濃度的表面活性劑易引起患者過敏性反應，同時靜脈滴注給藥，一過性給藥劑量過大，對機體的毒副作用過大。

抗腫瘤藥物多具有毒性, 而且溶解性較差, 體內的生物利用度不高, 不適宜制成口服制劑，臨床上常用的劑型為注射用溶液劑和凍干粉針劑，給藥途徑也比較單一，一般為靜脈滴注, 給藥過程復雜漫長。靜脈滴注給藥時，藥物一過性給藥劑量較大,對機體的整體傷害大，并且藥物在短時間內代謝完畢，給藥間期不能對腫瘤起到持續殺傷作用。同時，為解決藥物的低溶解性, 所采用的溶劑往往也具有毒性，易引起多種不良反應。緩釋給藥制劑除了能夠避免上述注射劑的不足之處，能夠在特定部位持續釋放藥物，使藥物的體內水平始終維持在有效濃度, 對于腫瘤等頑固病灶具有強大殺傷力。

表 1 紫杉醇緩釋微球對卵巢癌裸小鼠原位移植瘤的影響Table 1 Effect of PLCE on ovarian cancer orthotopic transplantation

本研究中的紫杉醇長效緩釋微球, 是一種用生物可降解聚合物制成的緩釋微球制劑。制備的2個批次紫杉醇緩釋微球為白色粉末, 成球形好, 收率均大于80%, 包封率均大于90%, 顆粒直徑14～76 μm。實驗結果顯示, 2個批次的紫杉醇緩釋微球在60 mg/kg的劑量下動物存活情況較好, 紫杉醇緩釋微球2的抑瘤率高于紫杉醇緩釋微球1, 可能與紫杉醇緩釋微球2的包封率更高有關。紫杉醇緩釋微球2(60 mg/kg)對卵巢癌裸小鼠原位移植瘤有良好抑制效果, 但毒性仍然較大, 需進一步改進。

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[3] 王美清. 紫杉醇的臨床毒副作用分析及對策[J]. 中國熱帶醫學, 2007, 7(2):237-239.

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[10] 余志英, 李麗文, 杜靜, 等. 紫杉醇誘導卵巢癌細胞凋亡及細胞周期改變的研究[J]. 中國醫師雜志, 2006, 18(3):322-324.

Inhibition of Paclitaxel-Poly Lactic Acid Phosphate(PLCE) Microspheres on Growth of Ovarian Cancer Transplanted in Nude Mice

RAO Zi-liang1, WANG Yi1, WANG Nuo1, XIONG Ren-qing2, ZHANG MING-hao2, LOU Cai-xia1, KUANG Shao-song1, TANG Xiao-jiang1
(1. Guang Dong Medical Laboratory Animal Center, Foshan 528248, China; 2. Tianda Pharmaceuticals Limited, Zhuhai 519070, China)

ObjectiveTo observe the antitumor effect of paclitaxel- novel copolymer of poly lactic acid phosphate (PLCE) microspheres on proliferation of ovarian cancer.MethodsThe human overiam cancer (HO8910) were implanted into the ovarian capsule of 68 nude mice. Three weeks later, 42 tumor bearing nude mice were randomly divided into 7 groups as follow, blank control group, negative control group, paclitarel injection group, paclitaxel-PLCE microspheres 1 high and low dose group, and paclitaxel-PLCE microspheres 2 high and low dose group, with 6 nude mice in each group. The drug was administered 1 time a day, and the growth of the tumor were continuously observed for one month.ResultsThe tumor inhibition rate of paclitarel injection was 57.0%, and tumor inhibition rate of paclitaxel-PLCE microspheres 2 high and low dose group were 77.1% and 58.7% respectively.ConclusionPaclitaxel-PLCE microspheres have a strong inhibitory effect on HO8910 ovarian cancer transplanted in nude mice.

Paclitaxel; Microspheres; Ovarian cancer; Poly lactic acid phosphate (PLCE)

R965.1 Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0136-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.010

2016-11-14

廣東省科技計劃項目(2016A030303027、2013B060300033、2016A030303026)

饒子亮(1983-), 男, 副主任藥師, 從事抗腫瘤藥物篩選研究。E-mail: 343806059@qq.com

鄺少松(1973-), 女, 高級獸醫師, 主要從事比較醫學研究。E-mail: kuangss@126.com