腸道病毒71型體外感染樹鼩腎細胞特性觀察

王文廣, 匡德宣, 尹博文, 陸彩霞, 罕園園, 李 娜, 仝品芬, 孫曉梅, 蔡路奎, 代解杰

(中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心,云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室, 中國醫學科學院醫學生物學研究所實驗樹鼩標準化與應用研究省創新團隊, 昆明650118)

腸道病毒71型體外感染樹鼩腎細胞特性觀察

王文廣, 匡德宣, 尹博文, 陸彩霞, 罕園園, 李 娜, 仝品芬, 孫曉梅, 蔡路奎, 代解杰

(中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心,云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室, 中國醫學科學院醫學生物學研究所實驗樹鼩標準化與應用研究省創新團隊, 昆明650118)

目的 探討腸道病毒71型(EV71)對樹鼩腎細胞的感染特性。方法 通過組織塊貼壁法分離培養樹鼩原代腎細胞，觀察細胞形態并進行傳代培養，利用細胞角蛋白18 對樹鼩腎細胞進行間接免疫熒光鑒定。用EV71感染樹鼩腎細胞，通過倒置顯微鏡觀察細胞病變情況，結合間接免疫熒光實驗觀察細胞中病毒蛋白的表達情況，采用實時熒光定量PCR技術檢測病毒載量，以Vero細胞為對照，研究EV71對樹鼩腎細胞的感染情況。結果 通過組織塊貼壁法可以快速獲得樹鼩原代腎細胞，并可進行多次傳代培養，細胞為梭形，貼壁呈鋪路石狀，免疫熒光鑒定為腎上皮細胞。EV71可以感染樹鼩腎細胞，使之出現明顯的細胞變圓、脫落或解體等病變，免疫熒光實驗可以觀察到病毒蛋白的分布，實時熒光定量PCR檢測病毒載量最高可達105拷貝/mL，病變情況和增殖趨勢與Vero細胞相似。結論 EV71可以體外感染樹鼩腎細胞，該細胞模型可為EV71藥物篩選和感染機制研究提供平臺。

樹鼩; 腎細胞; 腸道病毒71型(EV71)

腸道病毒71型(EV71)為引起兒童手足口病主要病原體之一, 可使重癥患兒出現肺水腫、腦炎等癥狀，嚴重危害嬰幼兒生命和健康[1]。樹鼩作為一種新型實驗動物，在復制人類疾病和藥物評價應用中獨具優勢，近年來在生物醫學研究領域，尤其是病毒學方面受到越來越多的重視。研究表明[2]，幼齡中緬樹鼩(Tupaia belangeri chinensis)可以感染EV71，表現出一系列與人相似的臨床癥狀，有望成為一種新的手足口病動物模型而被應用于EV71的基礎或臨床研究，而建立樹鼩細胞水平的感染模型不僅能對上述研究進一步補充完善, 更能為EV71的感染機制研究和藥物篩選評價提供新的實驗平臺。非洲綠猴腎細胞(Vero細胞), 是目前公認的一種良好的病毒培養載體[3,4], 本研究以此細胞為對照,通過對樹鼩腎細胞的分離培養和EV71感染實驗, 初步探討建立EV71感染樹鼩腎細胞模型的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 經人工繁育的F1代成年中緬樹鼩，來自中國醫學科學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心[SCXK(滇) K2013-0001], 飼養于本中心普通級環境中的樹鼩專用不銹鋼籠具內[SYXK(滇) K2013-0001]。

1.1.2 細胞和病毒 Vero細胞和EV71標準毒株(FY-23), 均來自中國醫學科學院醫學生物學研究所。1.1.3 主要儀器 日立臺式離心機(CT15RE，日本日立公司)，實時熒光定量PCR儀(CFX 96，美國BIO-RAD公司), 尼康倒置熒光顯微鏡(ECLIPSE, 日本尼康公司), 二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)。

1.1.4 主要試劑 DMEM培養基、 質量分數0.25%胰蛋白酶溶液、雙抗(美國HyClone公司)，胎牛血清(美國BI公司)，細胞角蛋白18抗體(美國Abcam公司)，腸道病毒EV71抗體(美國Millipore公司)，熒光標記的兔抗鼠IgG(德國Merck公司)，RNAiso Plus(D9108A), 實時定量RT-PCR試劑(DRR064A)(大連寶生物公司), 引物探針均由大連寶生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樹鼩腎細胞的原代培養 選F1代成年樹鼩脫頸處死，無菌取腎，剔除包膜，用含體積分數1%雙抗的PBS反復沖洗干凈；取腎皮質部分，剪成1 mm3組織小塊，用含1%雙抗的PBS反復沖洗，并吸棄上清; 用眼科鑷結合加樣槍將組織塊分散布入25 cm2培養瓶中。翻轉培養瓶，加入3 mL含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液，于二氧化碳培養箱中(37 ℃, 體積分數5% CO2)倒置培養1～2 h,然后輕輕翻轉正置培養。培養期間根據生長情況更換培養液，使用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 樹鼩腎細胞的傳代培養 對從組織塊周圍遷出且鋪滿瓶底80%左右面積的原代腎細胞進行首次傳代培養, 加質量分數0.25%胰酶消化并按照1∶2進行傳代培養，定期觀察并拍照。

1.2.3 樹鼩腎細胞細胞免疫熒光鑒定 樹鼩腎細胞接種至6孔板，待其80%鋪滿孔底后，PBS 清洗2次，使用質量分數4%多聚甲醛溶液固定20 min; PBS 清洗3次，質量分數0.5%的Triton-X100穿孔15 min; PBS 漂洗3次, 山羊血清封閉液封閉30 min, PBS 漂洗3次，加入質量分數3% BSA 稀釋的小鼠角蛋白18單克隆一抗(1∶200)，4 ℃過夜; PBS漂洗3次，加入1%BSA 稀釋的熒光標記的兔抗鼠IgG(1∶200)，37℃避光孵育1; 暗光環境中，PBS漂洗3次，滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育5 min，對標本進行染核; PBS 漂洗3次，洗去多余的DAPI; 在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.2.4 EV71感染實驗 選擇貼壁完全的樹鼩腎細胞，以質量分數0.25%胰酶消化后制備密度為5× 104/mL的細胞懸液, 按每孔2 mL接入12孔板, 待形成細胞單層(90%鋪滿瓶底)，吸棄培養液，PBS沖洗細胞單層，分別按10 TCID50、100 TCID50、1 000 TCID50接種EV71病毒0.1 mL，同設空白對照, 培養基為不含血清的DMEM培養液, 培養期間定期進行觀察拍照, 使用EV71抗體按照1.2.3步驟進行免疫熒光觀察, 以質量分數Vero細胞作對照進行同樣處理。

1.2.5 EV71培養物的采集 選擇貼壁完全的樹鼩腎細胞, 質量分數以0.25%胰酶消化后制備密度為5× 104/mL的細胞懸液, 按每孔1 mL接入24孔板, 待細胞貼壁形成90%單層, 以PBS沖洗后按100 TCID50每孔接種EV71病毒0.05 mL，無血清DMEM培養，分別在接種后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h收集病毒培養上清，待測病毒載量，以Vero細胞作對照進行同樣處理。

1.2.6 病毒增殖曲線 Trizol法提取病毒培養上清中RNA，按寶生物試劑盒DRR064A說明進行實時RT-PCR操作, 根據不同時間點病毒的載量繪制增殖曲線。定量標準品稀釋梯度為107拷貝/μL、106拷貝/μL、105拷貝/μL、104拷貝/μL、103拷貝/μL,引物探針根據EV71(FY-23)基因序列保守區設計:

上游引物: 5'-CGCTTTGACGCAGAGTTCACT-3';

下游引物: 5'-TTGGAGCAATTGTGGGACGA-3';

探針: 5'-FAM-TTGTTGCGTGCACACCCACCG-BHQ1-3'。

2 結果

2.1 樹鼩腎細胞原代培養

在倒置相差顯微鏡下觀察, 經原代培養2～3 d可見樹鼩腎組織塊附近有細胞遷出，5 d左右可見密集的單層貼壁細胞(圖1), 細胞形態以梭形為主，排列緊湊，與Vero細胞相似，貼壁呈鋪路石狀。

2.2 樹鼩腎細胞傳代培養

樹鼩原代腎細胞37 ℃培養5 d左右基本可以鋪滿瓶底，可用質量分數0.25%胰酶消化進行細胞的第一次傳代。樹鼩原代腎細胞細胞可以連續進行多次傳代培養(圖2)，細胞能夠保持旺盛活力，2～3 d即可鋪滿瓶底，細胞形態逐漸均一，緊密貼壁呈現出明顯的鋪路石狀。

2.3 樹鼩腎細胞免疫熒光鑒定

培養的樹鼩腎細胞用角蛋白18單抗進行免疫熒光鑒定，普遍呈陽性反應(圖3)，陽性比例達到95%以上，鑒定結果與Vero細胞一致，可以認定為樹鼩腎上皮細胞。

2.4 EV71對樹鼩腎細胞的感染情況

圖 1 樹鼩原代腎細胞形態Figure 1 Morphology of primary kidney cells in tree shrews

圖 2 樹鼩腎細胞傳代培養形態Figure 2 Subculture morphology of tree shrews kidney cells

圖 3 樹鼩腎細胞免疫熒光鑒定Figure 3 Immunofluorescence identification of kidney cells in tree shrews

圖 4 EV71感染樹鼩第3代腎細胞Figure 4 The third generation kidney cells of tree shrew infected with EV71

圖 5 EV71感染Vero細胞Figure 5 Vero cells infected with EV71

圖 6 EV71感染樹鼩腎細胞的免疫熒光觀察Figure 6 Immunofluorescence observation on kidney cells of tree shrew infected with EV71

分別采用10 TCID50、100 TCID50、1 000 TCID50三個劑量的EV71病毒感染第3代樹鼩腎細胞，定期在倒置顯微鏡下觀察病變情況。結果顯示，接種EV71病毒12 h后，100 TCID50和1 000 TCID50兩個劑量組的樹鼩腎細胞單層開始由緊密變得稀疏,少量細胞變圓，脫落, 其中病變情況以1 000 TCID50劑量組較為明顯; 接種病毒24 h后，可見明顯細胞變圓、漂浮和脫落，細胞單層逐步解體; 接種病毒48 h后，細胞絕大部分都已病變、解體，基本觀察不到完整的細胞形態。10 TCID50劑量組在接種后的48 h才開始出現少量的細胞變圓脫落，整個感染進程相對緩慢。以100 TCID50感染劑量組來做比較，樹鼩第3代腎細胞病變情況與進度(圖4)與Vero細胞(圖5)大致相似。

通過免疫熒光實驗可以觀察到EV71病毒蛋白在樹鼩腎細胞上的表達情況(圖6), 接種病毒6 h開始有少量病毒蛋白出現, 12 h后可以觀察到病毒蛋白增多,分布在細胞質中靠近細胞核的部位, 24 h即可觀察到更為密集的病毒蛋白, 48 h病毒蛋白遍布整個視野,病毒在樹鼩腎細胞上的增殖趨勢與Vero細胞一致。

2.5 病毒增殖曲線

采用實時熒光定量PCR的方法連續檢測EV71病毒RNA在樹鼩腎細胞上的復制情況，從病毒增殖曲線(圖7)可以看出EV71在剛接種的12 h內增殖緩慢，而在隨后的24 h內快速復制，在接種48 h前后達到峰值，病毒載量最高可達105拷貝/mL以上。EV71在樹鼩腎細胞上的增殖情況稍弱于Vero細胞，但兩者大致趨勢相似。

圖 7 EV71感染樹鼩腎細胞的增殖曲線Figure 7 Proliferation curve of EV71 in kidney cells of tree shrew

3 討論

樹鼩作為一種新型實驗動物, 由于能夠成功復制多種人類疾病, 越來越受到科研人員重視。但由于樹鼩標準化程度不高、個體間差異較大等因素,其疾病模型的可重復性和穩定性均存在問題, 在一定程度上影響實驗結果判定。相對而言, 細胞感染模型能較好地避免或減少個體差異的干擾，可以對體內感染模型起到補充驗證作用, 而且在細胞水平上可以很方便地開展病毒感染規律與入侵機制的研究, 還能為藥物篩選等研究提供體外實驗平臺。許多研究證實[5,6]樹鼩可感染人乙型肝炎病毒(HBV), 而其感染機制的突破則更多是借助細胞平臺實現的, 比如HBV關鍵受體牛黃膽酸鈉共轉移多肽(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)就是在樹鼩原代肝細胞感染實驗中發現的[7], 另有體外實驗證明[8], Kupffer細胞中Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2) 和TLR4與HBV慢性化感染進程相關。

此前有研究證實[2]，EV71可感染幼齡中緬樹鼩，使之表現出與人手足口病相似的癥狀。本研究在此基礎上，嘗試建立EV71感染樹鼩腎細胞的體外模型，進行樹鼩腎細胞的分離培養是其關鍵的第一步。目前常用的腎細胞分離方法有組織塊貼壁培養法、膠原酶、胰蛋白酶以及兩者的組合消化法和聯合EDTA結合法等[9,10]。本實驗初步證明，采用組織塊貼壁法即可快速制備成年樹鼩的原代腎細胞。實驗表明，該細胞對培養條件的要求并不高，使用常規的含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基即可。由于采用了比較簡單的組織塊貼壁法，使得樹鼩原代腎細胞成分較為復雜，但可以利用不同細胞貼壁能力的差異，通過胰酶的分步消化進行簡單純化。初步純化后的樹鼩腎細胞與Vero細胞形態十分相似，主要為梭形，傳代培養2 d左右即可形成緊密的單層, 表現出典型的鋪路石狀。通過間接免疫熒光實驗可以看到，本實驗所分離培養的樹鼩腎細胞普遍表現出角蛋白18陽性,可以認定為腎上皮細胞。樹鼩腎細胞可以進行多次傳代，傳代3次后的細胞仍能保持均一的細胞形態和旺盛的細胞活力，這就為后續的病毒感染實驗奠定了基礎。

以100 TCID50的EV71病毒感染樹鼩腎細胞，2 d左右可在顯微鏡下觀察到明顯的細胞變圓、脫落和解體等病變，間接免疫熒光觀察可見病毒蛋白在樹鼩腎細胞中的表達情況，病毒載量最高可達105拷貝/mL以上，其細胞病變情況和病毒感染進程與Vero細胞大致相似，這些實驗數據證明EV71可以感染樹鼩腎細胞，也意味著建立EV71感染樹鼩腎細胞的體外實驗模型是可行的。綜合細胞病變情況和病毒載量增殖趨勢，在接種EV71病毒后的12 h內，細胞尚未明顯的病變，病毒載量也保持較低水平，表明病毒接種后有一個適應期，而在這個階段病毒如何入侵樹鼩腎細胞、結合了哪些關鍵受體，這些科學問題或將可以依靠此細胞感染模型得以深入探討。

[1] Xiaobo Lei, Sheng Cui, Zhendong Zhao, et al. Etiology, pathogenesis, antivirals and vaccines of hand, foot, and mouth disease[J]. Natl Sci Rev, 2015, 2(3):268-284.

[2] 王文廣, 黃曉燕, 徐娟, 等. EV71可感染幼齡中緬樹鼩[J].動物學研究, 2012, 33(1):7-13.

[3] 陳麗, 江元翔, 夏德鎮, 等. 腸道病毒71型在Vero細胞中培養條件的優化[J]. 中國生物制品學雜志, 2013, 26(01):105-108.

[4] 張英偉, 李衛東, 馬娜, 等. 以重配技術制備H1N1流感病毒Vero細胞適應株[J].中國生物制品學雜志, 2009, 22(6): 529-532.

[5] Rongxia Li, Wei Xu, Zhen Wang, et al. Proteomic characteristics of the liver and skeletal muscle in the Chinese tree shrew (Tupaia belangeri chinensis)[J]. Protein Celt, 2012, 3(9):691-700.

[6] Qi Wang,Paul Schwarzenberger,Fang Yang,et al.Experimental chronic hepatitis B infection of neonatal tree shrews(Tupaia belangeri chinensis): a model to study molecular causes for susceptibility and disease progression to chronic hepatitis in humans[J]. J Virol, 2012, 9(1):170-179.

[7] Yan H, Zhong G, Xu G, et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus[J]. Elife, 2012, 1:e00049.

[8] Ruan P, Yang C, Li Y, et al. Expressions and significance of TLR2 an d TLR4 in Kupfer cells of tree shrews chronically infected with hepatitis B virus[J]. Chin J Cell Mol Immuno1, 2014, 30(7):686-690.

[9] 顧光, 高芃, 支媛, 等. 大鼠腎細胞分離制備及培養方法的比較[J]. 衛生研究, 2005, 34(5):574-576.

[10] 王慶華, 王富民, 李前勇, 等. 常用分離培養腎細胞方法的比較[J]. 安徽農業科學, 2012, 56(15):8536-8538.

Study on Infectivity of EV71 in Kidney Cells of Tree Shrew

WANG Wen-guang, KUANG De-xuan, YIN Bo-wen, LU Cai-xia, HAN Yuan-yuan, LI Na, TONG Pin-fen, SUN Xiao-mei, CAI Lu-kui, DAI Jie-jie
(Center of Tree Shrew Germplasm Resources, Institute of Medical Biology, the Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Diseases, Yunnan Innovation Team of Standardization and Application Research in Tree Shrew, Kunming 650118 China)

ObjectiveTo investigate enterovirus 71 (EV71) infection characters on the tree shrew kidney cells.MethodsThe primary kidney cells from tree shrew were isolated by tissue culture. The cell was passaged and morphology was observed regularly. The indirect immunofluorescence identification was performed by using keratin 18. Tree shrew kidney cells were infected with EV71, cell lesions were observed by inverted microscope, viral load was detected by real-time PCR. Vero cells were used as control.ResultsTree shrew primary kidney cells can be rapidly prepared by tissue culture and can be passaged easily. The kidney cells are mainly spindle-shaped and show paving - stones structure after adherent. They were identified as kidney epithelial cell by immunofluorescence assay. Tree shrew kidney cells can be infect with EV71 and showed significant cytopathic effect (CPE) such as rounding, falling off and lysis. The viral protein was observed by immunofluorescence. Viral load of was up to 105copies/mL. The CPE and proliferation trends were similar to that of Vero cell.ConclusionEV71 can infect tree shrew kidney cells under in vitro condition, and the cell assay can provide a platform for drug screening and infection mechanism research of EV71.

Tree shrew; Kidney cells; Enterovirus 71

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0123-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.008

2016-12-05

國家科技支撐計劃項目(2014BAI01B01); 云南省聯合支持國家計劃項目(2015GA009)

王文廣(1985-), 男, 助理研究員, 碩士, 研究方向: 人類疾病動物模型。E-mail: windgoon@foxmail.com

代解杰(1961-), 男, 研究員, 博士生導師。E-mail: djj@imbcams.com.cn