樹鼩角膜原代上皮細胞的分離培養、純化與鑒定

苗雨潤, 宋慶凱, 匡德宣, 陳玲霞, 尹博文, 李曉飛, 代解杰

(中國醫學科學院/北京協和醫學院, 醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心,云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室, 昆明 650118)

樹鼩角膜原代上皮細胞的分離培養、純化與鑒定

苗雨潤, 宋慶凱, 匡德宣, 陳玲霞, 尹博文, 李曉飛, 代解杰

(中國醫學科學院/北京協和醫學院, 醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心,云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室, 昆明 650118)

目的 建立樹鼩角膜上皮細胞(CECs)穩定的體外培養技術，為人類角膜疾病研究提供新的實驗材料。方法 使用改進的雙酶消化法取得樹鼩CECs, 用轉化生長因子-β(TGF-β)抑制劑配合梯度消化對樹鼩CECs進行純化，角蛋白3/12抗體對CECs進行免疫熒光檢測及鑒定。結果 優化的酶消化法可以快速、有效得到高純度的樹鼩CECs。TGF-β 抑制劑及梯度消化法可以達到良好的純化目的，純化的CECs在傳代過程中仍保持良好形態。樹鼩CECs免疫熒光染色顯示角蛋白3/12單克隆抗體陽性。結論 成功建立了一種有效、簡單、經濟適用的樹鼩角膜上皮原代細胞的體外培養技術，所獲得的原代細胞具有較好的上皮細胞形態特征并可以連續傳代，為眼科疾病的研究提供一種新材料。

樹鼩; 角膜上皮細胞(CECs); 原代培養; 優化; 鑒定

角膜細胞的成功培養是近年來角膜病研究與治療的基礎，隨著研究進展的日漸深入，對角膜細胞的培養提出了更高要求。近年來，隨著細胞體外培養技術的發展, 體外構建生物工程角膜進行移植成為治療角膜病新趨勢，其中高質量的角膜上皮種子細胞是構建生物工程角膜并成功移植的重要影響因素[1]。但由于人類角膜供體的極其短缺，限制了實驗研究的進展，因此，尋找一種合適的、可以代替人類角膜上皮細胞(CECs)迫在眉睫。目前，成功的原代CECs培養模型已經從人、兔、鼠、牛和豬[2-6]以及猴制備而得。但是，由于這些動物與人類的種屬差異性過大或角膜的結構和形態與人類角膜的結構形態差異極大，從而無法應用于人類角膜疾病病理及藥理的研究。獼猴的角膜結構及角膜細胞形態與人高度相似，被認為可以用于人類角膜疾病研究[7]，但由于獼猴的應用成本過高且存在一定的倫理學爭議，一直以來未能廣泛應用于角膜疾病動物模型的構建。近年來，樹鼩作為一種新型實驗動物，因其分類地位上相比小鼠和大鼠要更接近于人，加之易于飼養與分布廣泛的特點，目前已經廣泛應用于多種人類疾病模型的研究，具有很強的應用潛力[8]。近年有學者[9]研究表明，樹鼩角膜細胞的形態與發育過程都與人類的角膜細胞具有高度的相似性，其角膜的組織學特點、相關參數以及與人類的相似度引起了研究人員高度關注，被認為是一種可用于研究人類角膜疾病的實驗動物。雖然CECs的培養在國內外已有不少報道，且培養技術一直不斷改進[10-12]，但目前仍沒有任何關于樹鼩CECs體外培養的報道。以往報道的關于角膜細胞的培養技術一直存在方法復雜和培養條件昂貴，對細胞損傷較大導致細胞活力降低，以及雜質成纖維細胞難以被去除等問題，導致得到CECs純度不高、難以傳代、細胞形態易發生改變，這嚴重制約了體外培養的角膜細胞的應用范圍。此外，經試驗驗證，已報道的方法也并不適用于樹鼩的CECs培養，因此，尋求一種有效、簡單、經濟的方法來建立樹鼩CECs，對眼表疾病、角膜病的基礎研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗使用的滇緬樹鼩是由中國醫學科學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心提供的1月齡樹鼩4只(雌雄不限)[SCXK(滇)K2013-0001]，[SYXK (滇)K2013-0001）]。

1.2 主要試劑及儀器

Ham’s F12細胞培養液、M199細胞培養液、青霉素、鏈霉素均購自美國HyClone公司; 胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液均購自以色列BI公司; 抗壞血酸鈉購自北京索萊寶科技有限公司; ITS(Insulin-Transferrin-Selenium Solution)購自美國Gibco公司; 選擇性ALK5抑制劑(SB431542)購自美國Selleck公司; 表皮細胞生長因子(EGF)購自美國PeproTech公司, 小鼠角蛋白3/12 (CK3/12)單克隆抗體(ab68260)購自英國Abcam公司;熒光標記的兔抗鼠IgG(H+L)購自美國Merck公司;硫酸軟骨素購自山東西亞試劑公司, 顯微操作儀(CDSD230)、倒置顯微鏡(ECLIPSE)均購自日本Nikon公司; CO2孵育箱(CO2T/C)購自美國Thermo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樹鼩原代CECs的取材 取1月齡樹鼩，注射1 mL質量分數1%戊巴比妥鈉溶液致死，將其完整角膜取下后剪碎，加入3 mL消化液(膠原酶75 μg/mL, 中性蛋白酶20 μg/mL, DTT 0.5 mg/mL, 體積分數1% FBS，DMEM 低糖)，置于37 ℃搖床上消化2 h后1 500 r/min離心10 min，用培養液沖洗3次后重懸細胞，吹打混勻后移至25 cm2培養瓶中，在37℃，體積分數5%CO2條件下培養。

1.3.2 原代細胞培養 使用Ham’s F12/M199以1∶1配制的培養液培養原代細胞，在上述培養基內添加體積分數5%FBS，5 μg/mL抗壞血酸鈉溶液, 5 μg/L胰島素, 體積分數1% ITS, 5 ng/mL EGF，100 U/m L 青霉素和100 μg/mL鏈霉素，5 ng/mL EGF。在37 ℃，體積分數5% CO2條件下培養，隔日換液。

1.3.3 樹鼩CECs的純化 在原代細胞生長融合至50%, 在培養液內添加轉化生長因子-β(TGF-β)抑制劑(10 μmol/L)抑制雜質成纖維細胞生長, 每隔3 d觀察一次純化效果。

聯合使用梯度消化法去除雜質成纖維細胞，即使用質量分數0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液消化1～2 min，電子顯微鏡下觀察到大部分成纖維細胞變圓、懸浮后用含體積分數10%FBS細胞培養液終止消化，反復吹打后棄掉消化下來的細胞，PBS沖洗3次后添加培養液繼續培養。

1.3.4 樹鼩CECs的鑒定 角蛋白3/12(CK3/12)免疫熒光染色鑒定純化的、傳至P3代的CECs，待其生長至80%融合后，PBS清洗2次，使用質量分數4%的甲醛溶液固定20 min，PBS清洗3次(每次2 min)，0.5%的Triton-X100穿孔15 min，PBS漂洗3次，山羊血清封閉液封閉30 min，PBS漂洗3次, 加入質量分數3%BSA稀釋的小鼠角蛋白3/12單克隆一抗(1∶200)，4 ℃過夜，PBS漂洗三次，加入質量分數1% BSA稀釋的熒光標記的兔抗鼠IgG(1∶200), 37 ℃孵育1 h，PBS漂洗三次，抗淬滅封片劑封片, 在熒光顯微鏡下觀察。對成纖維細胞用相同方法進行免疫熒光染色, 作為陰性對照。

2 結果

2.1 樹鼩CECs形態學觀察結果

實驗得到的樹鼩CECs長勢良好，12～18 h后見多數細胞貼壁，形態呈現多樣性，以卵圓形、長梭形為主。3 d后見細胞呈乳頭狀向周圍漩渦狀散開，局部密度明顯增高，呈扁平單層多邊形形態，少部分外圍細胞呈長梭形, 具有偽足。6～7 d后，大部分細胞融合為一個圓形細胞群落，細胞形態以多邊形、單層為主，少部分細胞呈長梭形放射狀生長，表明有基質細胞參雜其中。12 d左右細胞基本達到融合狀態，形態呈扁平單層不規則多邊形，部分細胞體積增大。此時可進行傳代，經純化的細胞傳代過程中仍可維持良好形態(圖1)。

2.2 樹鼩CECs的鑒定

角蛋白3/12免疫熒光染色結果呈陽性，符合樹鼩CECs的一般特征，對照組成纖維細胞呈陰性結果。使用DAPI對細胞核進行復染以初步鑒定上皮細胞的純度，結果顯示純度高達95%以上(圖2)。

圖 1 樹鼩CECs形態學觀察Figure 1 The morphology of corneal epithelial cell from tree shrew in culture

圖 2 樹鼩CECs的免疫熒光鑒定(100×)Figure 2 Immunofluorescence of corneal epithelial cells from tree shrew (100×)

3 討論

自1950年代細胞體外培養技術興起以來，關于角膜細胞的培養在國內外已有不少報道，雖然相關培養技術一直在不斷改進，且眼表疾病的臨床前與臨床研究日益增多，但可以應用于人類角膜疾病研究的角膜細胞模型的建立一直難以實現[13]。近年來，樹鼩作為一種新型的實驗動物被廣泛應用于人類疾病動物模型的建立。目前研究[9]已表明樹鼩的角膜與人類的角膜無論從結構還是細胞形態上都高度類似，但并沒有針對樹鼩角膜細胞體外培養的相關報道。

目前, 原代CECs培養模型已經成功從人、兔、鼠、牛和豬[14]以及猴制備而得。Kawazu等[15]最先開發了一種兔原代CECs培養模型，主要用于研究藥物的滲透和主動轉運。此細胞模型雖然具有與完整的兔角膜類似的復層結構和橋粒，但是該模型的細胞跨膜電阻值(trans epithelial electrical resistance)只有150 Ψ/cm2，而且14C甘露醇的滲透性為離體兔角膜的100倍[16]，說明細胞間緊密性連接較差,不能合理表征其屏障功能,故應用受到限制。而類似及更嚴重情況同樣出現在鼠、牛等動物的CECs培養模型中，這表明這些動物可能很難被應用于人類角膜疾病病理方面的研究[17]。除此之外, 兔角膜面積是人角膜的2倍, 且眨眼頻率不同，兔5次/h的低眨眼頻率較人6～7次/min相比，減少了角膜前的藥物溶液的流失[18]，而其他動物諸如牛、豬等又與人存在極大的種屬差異而不能應用于藥理方面的研究。合適的人類角膜疾病動物模型及細胞模型的缺乏，一直以來極大地限制了應用于人類角膜疾病病理及藥理研究的發展。不同于以往的實驗動物，樹鼩的眨眼頻率在1～3次/5 min，這一點在相對于兔等動物方面與人類具有高度相似性。此外，有學者[19]用電子顯微鏡觀察了樹鼩角膜的超微結構，顯示樹鼩的角膜厚度雖然只有人類角膜的一半，但角膜結構與人類非常相似，從前向后也分為角膜上皮層、前彈力層、基質層、后彈力層和角膜內皮層，而絕大部分動物并不具有這樣的結構，且樹鼩角膜各層結構占角膜厚度的比例也跟人類的極為相似。也有學者[20]在比較了7種動物的角膜組織結構后認為兔是7種動物中最接近于人角膜結構的動物，可即便是最接近的，其與人角膜結構及形態的差異也相去甚遠。吳敏等[21]研究表明，獼猴與樹鼩由于在角膜上的各項參數與細胞形態上與人類的角膜高度相近，故認為獼猴與樹鼩都可以作為研究人類角膜疾病合適的動物。本實驗所取得的樹鼩CECs無論從細胞形態、細胞大小還是單位面積的細胞數量上與活體內的樹鼩CECs相比較都高度相似，初步認為具有樹鼩活體CECs的一般特征，可以應用于人類角膜疾病的藥理研究。

以往的CECs取材方法總結包括3種：組織塊貼壁法[22]、消化法[23]與混合法[24]。本實驗優化建立了一套適用于樹鼩CECs的新的體外培養技術，本試驗所采用的消化法沒有選用對細胞損傷較大的胰酶，而是采用了對細胞損傷較小的膠原酶和中性蛋白酶，通過成分與配比的優化以達到消化目的，并且由于操作相對簡單、體系更為封閉，從而大大降低了細胞被污染的幾率。此外，以往使用傳統消化法獲得的CECs難以維持上皮細胞形態，并且由于胰蛋白酶對細胞傷害較大而影響傳代數。本方法取得的樹鼩CECs在后續的傳代過程中沒有出現明顯的細胞衰老現象并保持了良好的上皮細胞形態，至少可以傳至P18代細胞，鏡下觀察未出現明顯的細胞活力降低現象。以往的CECs體外培養實驗的難以持續，很大程度上是由于雜質成纖維細胞的難以被去除。Okimaru等[25]研究表明，使用TGF-β抑制劑(SB431542)可以抑制人成纖維細胞的生長，本試驗嘗試使用了TGF-β抑制劑(SB431542)以期達到純化目的，結果表明這種TGF-β抑制劑對樹鼩成纖維細胞的生長具有一定的抑制作用。此外，為實現更高程度的純化目的，本實驗在使用TGF-β抑制劑的基礎上聯合梯度消化法，可以將純化效率達到95%以上。

樹鼩CECs的培養及細胞系模型的建立為研究人類角膜病及眼表疾病提供了有效的研究手段。但本實驗目前缺乏對體外原代培養細胞與活體細胞間系統的形態學及電生理學方面數據比較，不能明確兩者間差異，故仍需不斷完善。后續實驗中發現，在傳代過程中，傳代超出P20代后細胞體積逐漸變大，細胞間隙也逐漸變大，當傳至P25代以后細胞活力會逐漸下降，這可能與培養液中缺乏一些相關的細胞生長因子及彈力層細胞分泌的一些調節性旁分泌因子有關系，后續實驗將圍繞共培養及細胞信號通路等方面來探索著一種情況發生的可能性，使細胞更接近于活體CECs的生理或病理狀態，從而可以更真實、全面、良好的反映角膜病及眼表疾病的病因、發病機制、藥物防治的情況，此外也可作為樹鼩CECs永生化的研究提供細胞源。總而言之，本研究通過長時間試驗及多種方法的比較的證實，本實驗方法所取得的CECs經免疫學鑒定是實驗預期需要的種子細胞，不僅分離培養的條件相對容易，而且可以長期維持良好的CECs形態學特征并可以連續傳代，是可靠的、可用的樹鼩CECs。

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Primary Isolation, Culture, Purification and Identification of Corneal Epithelial Cells in Tree Shrew

MIAO Yu-run, SONG Qing-kai, KUANG De-xuan, CHEN Ling-xia, YIN Bo-wen, LI Xiao-fei, DAI Jie-jie
(Center of Tree Shrew Germplasm Resources, Institute of Medical Biology, the Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Diseases, Kunming 650118, China)

Objectives To establish a stable technique for primary isolation, culture and purification and identification of tree shrew (Tupaia belangeri) corneal epithelial cells, and to provide a new experimental material for reserch of human ophthalmic corneal diseases.MethodsThe primary corneal epithelial cells from tree shrew were obtained by improved double digests method, the cells were purifed by method of cornea peeled off with transforming growth factor(TGF)-β inhibitors, achieve the purpose of identification by the method of immunofluorescence with keratin 3/12 antibody.ResultsThe primary corneal epithelial cells from tree shrew with high activity and purity were obtained by double digests method. The corneal epithelial cells were purified food by TGF-β inhibitors and gradient digestion, and the purified cells was maintained a good epithelial cells shape in the subculture. The result of tree shrew corneal epithelial cells by immunofluorescence staining with keratin 3/12 monoclonal antibodies were shown positive.ConclusionAn efficiency, simple and economic method was estabilshed for in vitro tree shrew corneal epithelial cells. The primary corneal epithelial cells from tree shrew with high activity and purity were obtained by double digests method, the subcultured cells was maintained a good epithelial cells shape. It will supply a new materials for eye diseases research .

Tree shrew (Tupaia belangeri); Corneal endothelial cells; In vitro; Primary culture; Optimization

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0130-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.009

2016-08-01

國家科技支撐計劃項目 (2014BAI01B00), 云南省聯合支持國家計劃項目(2015GA009)

苗雨潤(1993-), 男, 碩士, 研究方向: 人類疾病動物模型。 E-mail: miaomiao415@vip.qq.com

代解杰(1961-), 研究員。E-mail: djj@imbcams.com.cn