斑馬魚鰭和鱗片色素細胞的顯微觀察

林金杏, 馮麗萍, 胡建華, 高 誠

(上海實驗動物研究中心, 上海201203)

斑馬魚鰭和鱗片色素細胞的顯微觀察

林金杏, 馮麗萍, 胡建華, 高 誠

(上海實驗動物研究中心, 上海201203)

目的 觀察斑馬魚鰭和鱗片色素細胞的組成、分布及形態特征。方法 應用光學顯微鏡對AB品系斑馬魚鰭和鱗片色素細胞的顯微結構進行觀察。結果 斑馬魚鰭上分布有黑色素細胞和黃色素細胞，未觀察到虹彩細胞。根據色素細胞的分布規律，將斑馬魚鰭分為有、無斑馬魚條紋兩類。鱗片中分布有黑色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞。黑色素細胞較大，形態上主要分為呈樹突狀、顏色較淺、體積較大的I類黑色素細胞和呈團狀、顏色較深、個體較小的II類黑色素細胞。黃色素細胞個體最小，呈黃色或者橙黃色。虹彩細胞較長呈長棒狀或梭形，數量最少。結論 斑馬魚體表有黑色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞三種類型色素細胞，但鰭和鱗片在色素細胞組成和分布上存在著差異，鱗片中色素細胞的種類和形態特征較鰭中色素細胞更豐富。

斑馬魚; 鰭; 鱗片; 色素細胞; 黑色素細胞; 黃色素細胞; 虹彩細胞

魚類體色多種多樣, 同種不同個體, 雌雄之間都有可能不同。一般認為，魚類體色主要取決于皮膚和鱗片含有的色素細胞的種類及其不同數量分布[1,2]。硬骨魚類的色素細胞起源于神經嵴細胞[3]。相對于哺乳動物的一種色素細胞，硬骨魚具有多種色素細胞，根據所含的色素顆粒、色素色、運動性等可分為黑色素細胞(melanophore)、黃色素細胞(xanthophore)、紅色素細胞(erythrophore)、虹彩細胞(iridophore，又名鳥糞素細胞)和白色素細胞(leucophore)五種類型[4]。

斑馬魚(Danio rerio)屬于輻鰭亞綱(Actinopterygii)鯉科(Cyprinidae)Danio屬的一種熱帶魚。斑馬魚因個小易飼養、胚胎透明、繁殖力強、再生能力強、與人類基因高度同源及完整的基因組注釋等優點, 正在逐漸成為一種重要的脊椎模式動物新星[5-8],廣泛應用于遺傳學、免疫學、發育生物學、藥物學、行為學、毒理學、疾病模型等領域的研究[7-11]。目前，實驗動物已不限于大、小鼠等哺乳類動物，美國國立衛生研究院(NIH)已將斑馬魚列為第三大實驗動物[12]。NIH的研究資助金分析書表明，斑馬魚獲得的資助款年年攀升，從2008年時占R01 (研究計劃基金Research Project Grants)獎項的0.8%，2015年上升到1.27%，其研究經費已經超過了線蟲(Caenorhabditis elegans，0.98%)和爪蛙(Xenopus frogs，0.57%)[13]。在過去的十年中，我國的斑馬魚研究也得到了飛速發展，成立了國家斑馬魚資源中心(China Zebrafish Resource Center，CZRC)[14]，利用斑馬魚開展有關科研工作的實驗室已達250個以上[15]，在胚胎發育調控機制、疾病模型、免疫機制、藥物篩選及環境檢測等方面開展了卓有成效的工作。

由于國內在斑馬魚研究方面的歷史有限，相關研究的基礎資料和參考標準需要充實和完善。成熟的組織學平臺和結構模式的建立對于斑馬魚應用的推廣應用是個極大的促進，能減少無謂的動物處死和提供正常組織的參考。本課題組曾對斑馬魚重要器官進行了一系列的形態結構研究，包括肝臟膽管系統、腸道、生殖系統(卵巢和精巢)、神經系統(腦)等器官[16-21]。斑馬魚是一種研究色素模式形成機制的良好動物模型[22-24]。斑馬魚各器官和組織在解剖學、組織學上和分子水平上已被證實與哺乳動物類似，但魚類特有鰭和鱗的結構及其體色特征與哺乳動物相差甚遠。目前國內外鮮有斑馬魚色素細胞形態的詳細報道，因此，對斑馬魚體色(鰭和鱗片色素細胞)的研究有助于推進其作為水生實驗動物的應用。斑馬魚野生型品系純系主要有TU和AB,本文將選用AB品系斑馬魚，通過光學顯微鏡對其魚鰭和鱗片的色素細胞進行記錄并分析，完善斑馬魚形態學資源庫，為后續的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用魚飼養于本單位[SYXK(滬)2013-0056]獨立水生動物養殖系統(ZB2550SASX5，意大利Tecniplast)，水溫28.5±0.5 ℃, 光照周期明14 h∶暗10 h, 水體pH 7.0～7.5, 電導率500～550 μS/cm,每日兩次定時喂養。選用30尾30～35周齡的已經性成熟的野生型AB系斑馬魚，雌雄各半，全長3.60～4.20 cm，體長2.80～3.45 cm，體質量0.38～0.70 g。取材前禁食12 h，并用0.016% MS-222麻醉處死。

1.2 樣品制備與觀察

體視顯微鏡(Stemi 508, Zeiss, 德國)下, 完整剪取斑馬魚的背鰭、胸鰭、腹鰭、臀鰭和尾鰭(圖1),用分離針分別剝離鰭相連體位的鱗片3～5片、背部前后兩處和側線附近條紋上的3～5鱗片(圖1中圓點示鱗片剝離點)，分別置于生理鹽水中。斑馬魚鰭和鱗片較薄且透明，制作臨時玻片后可直接在光學顯微鏡(DP 80，Nikon，日本)下觀察。用CellSens Standard軟件對各個部位的不同種類的色素細胞進行拍照并測量細胞大小。

1.3 統計與分析

所得數據采用SAS 8.0軟件中GLM過程進行方差分析, 檢驗誤差為5%水平, 數據用平均值±標準誤表示, 用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 斑馬魚鰭色素細胞的種類和形態

圖 1 斑馬魚鰭和鱗片的色素細胞觀察點

在斑馬魚鰭上，可觀察到黑色素細胞和黃色素細胞兩種類型的色素細胞(圖2)。黑色素細胞表現出兩種不同的形態：I類為細胞體積較大(直徑50.57±1.99 μm，n=75)，顏色較淺，樹突較為明顯，呈散射狀(圖2A)、彌散狀(圖2B)或分枝狀(圖2C); II類為細胞體積較小(直徑25.52±0.99 μm, n=75)，顏色較深，無樹突形態，呈高密度的團塊狀(圖2B)。偶爾可見處于分裂期明顯雙核的黑色素細胞(圖2D)。黃色素細胞呈黃色或者橙黃色顆粒狀(圖2E)，單獨或者零散地分布于黑色素細胞間，但極少見黑色素細胞分散于黃色素細胞間(圖2A)。黃色素細胞的體積(直徑16.18±0.59 μm，n=75)顯著性小于黑色素細胞(圖3, P＜0.05)。在斑馬魚鰭中未觀察到典型的虹彩細胞分布，但在鰭條中可見晶體狀的類似鳥糞素顆粒分布(圖2F)。

2.2 斑馬魚鰭中色素細胞的組成和分布

根據色素細胞分布情況，本文將斑馬魚鰭分為兩類，I類無斑馬紋的鰭，如背鰭、胸鰭和腹鰭(圖4); II類斑馬紋鰭, 如臀鰭和尾鰭(圖5)。I類鰭細胞分布較分散，細胞間界限明顯，以背鰭上色素細胞分布最為豐富。I類鰭遠體端末梢主要為黃色素細胞，極少見有黑色素細胞分布，形成明顯的色帶。相對于I類鰭，II類鰭色素細胞數量多，細胞排列緊密，同類細胞聚集在一起并有規律的排列，整體觀呈斑馬紋圖案，并于體側的斑馬條紋基本平行，其中尾鰭的條紋形狀呈對稱形狀(圖1、5)。斑馬魚五種鰭中同一種色素細胞在不同的鰭中大小存在明顯差別, 特征最明顯的是II類鰭中黃色素細胞體積顯著大于I類鰭的黃色素細胞體積(圖6，P＜0.05)。

圖 2 斑馬魚鰭的色素細胞形態

2.3 斑馬魚鱗片細胞色素的種類和形態

斑馬魚鱗片上可觀察到三種類型的色素細胞:黑色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞(圖7)。斑馬魚鱗片中黑色素細胞數量最多，除有鰭中的兩種形態外，還有兩種形態。III類黑色素細胞為一種大小介于I類、II類之間，細胞體積較大(直徑42.61 ±1.01 μm，n=45)，顏色較淺，棕褐色或藏青色，呈中等均勻密度的圓形(圖7C); IV類較少見，細胞界限不清晰，呈云片狀，顏色較淺，黑色素顆粒散在分布(圖7D)。I、II、III類黑色素細胞大小差異顯著(圖8，P＜0.05)。鱗片中的黃色素細胞呈黃色，較少見橙黃色, 根據其形態可以分為: I類為小體積(直徑10.68±0.46 μm，n=45)呈顆粒狀的黃色素細胞(圖7C)，在所有的色素細胞里體積最小(圖8); II類為細胞體積較大(直徑38.29±1.72 μm，n=45)，顏色較淺，呈散射狀、彌散狀或樹突狀(圖7E、F)。虹彩細胞為長棒狀或長梭狀(長軸×短軸: 89.00±8.58 μm×16.43±1.75 μm，n=45)，個體最大(圖8)，數量少，單獨存在或成群緊密排列分布于鱗片上(圖7G、H、I)。

2.4 斑馬魚鱗片上細胞色素分布特征

斑馬魚的鱗片可以分有色素細胞和無色素細胞兩種。本文觀察到有色素細胞鱗片的色素細胞分兩層分布(圖9A)，主要分布著黑色素細胞和黃色素細胞。從分布區域看，色素細胞主要分布在鱗片的頂區和側區的末端(圖9)，在鱗紋上一般無色素細胞或少量的黑色素細胞分布(圖9A、I)。在兩鱗片重疊部分的鱗溝上未見黑色細胞分布，鱗片的此區域一般為無色素細胞分布或者僅有少量黃色素細胞分布(圖9B、F)。斑馬魚不同部位的鱗片上色素細胞的分布表現也不同: 背鰭基部鱗片色彩鮮艷，頂區有大量的黑色素細胞和黃色素細胞分布(圖9B); 胸鰭和腹鰭基部鱗片多為透明不含色素細胞(圖9C)或有少量虹彩細胞分布(圖9D); 臀鰭基部鱗片分布的色素細胞介于背鰭和胸鰭之間，有少量的色素細胞分布，如黃色素細胞(圖9E); 尾鰭基部鱗片上色素細胞分布豐富(圖9F)，有部分鱗片僅有黑色素細胞(圖9G)，也有一半僅黃色素細胞一半黑色素細胞的(圖9H); 斑馬魚體側上鱗片形態與尾鰭基部鱗片相似，色素細胞有不對稱分布的(圖9G)，亦有均勻地對稱分布的(圖9I)。

圖 4 斑馬魚I類魚鰭(背鰭、胸鰭和腹鰭)色素細胞的組成和分布

3 討論

圖 6 斑馬魚五種鰭中色素細胞大小差異分析

硬骨魚是色素系統最復雜的脊椎動物，其體色具有最多元化的特質并取決于色素細胞的數量和種類[1,25]。魚類色素細胞主要分布在皮膚中, 而鰭和鱗片是皮膚的衍生物, 廣泛地分布著色素細胞[1,26]。目前對魚類體色的研究主要集中在鰭和鱗片組織的色素細胞上。本文在斑馬魚體表觀察到三種類型色素細胞: 黑色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞。不同種類的色素細胞其形態結構、色素色和呈色物質等優勢不同[27]。斑馬魚上觀察到的三類色素細胞分別會產生黑色素、黃蝶啶和反射的鳥嘌呤結晶。斑馬魚黑色細胞有兩類主要形態: 一種為樹突狀明顯、顏色較淺、體積較大的I類黑色素細胞，一種為樹突狀不明、顯顏色較深、呈團狀、個體較小的II類黑色素細胞，與鯽[1]、鯉[2]、曼龍魚[28]等硬骨魚體表黑色細胞形態相似。動物的黑色素可以分為呈黑色和褐色含氮的真黑素(eumelanin)和呈棕色有半胱氨酸等參與的棕黑素(phaeomelanin)[27]。Robert等[4]也將斑馬魚的黑色素細胞分為真黑素和棕黑素兩種。將黑色細胞分為I類和II類是目前國內外研究人員廣泛認同的分類方式, 未見更細的分類報道。因此, 本文在斑馬魚鱗片上觀察到的III類和IV類黑色素細胞在廣義上可以歸入I類。虹彩細胞是一種獨特的魚類色素細胞類型, 結構上與其反射光線的功能相適應[29]。斑馬魚的虹彩細胞個體較長,呈長棒狀或梭形, 僅分布在鱗片上。

圖 7 斑馬魚鱗片中色素細胞形態特征

圖 8 斑馬魚鱗片色素細胞大小差異分析

斑馬魚背部皮膚顏色較深呈藍灰色，身體兩側的皮膚呈藍色與銀白色或金黃色縱紋相間排列，條紋的方向可能取決于環境因素[4]。斑馬魚體表顯眼的斑馬條紋圖案是黑色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞三種不同類型的色素細胞通過細胞間的相互作用而形成，黑色素細胞和虹彩細胞通過縫隙連接可調節黃色素細胞的形態和密度，黃色素細胞則通過直接接觸誘導黑色素細胞膜去極化，相同類型的色素細胞間相互作用決定其在條紋形成過程中的集體遷移方向[25,30]。本研究發現斑馬魚鰭和鱗片在色素細胞種類、組成和分布上存在著差異，與鯽魚等情況相似[1]。從色素細胞的種類上看，斑馬魚的所有鰭均分布有黑色素細胞和黃色素細胞兩種類型色素細胞，而鱗片上中分布有黑色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞三種類型色素細胞。從色素細胞數量和分布情況看，斑馬魚鰭具有獨特的特征，本文首次將其分為兩類: I類無斑馬紋的鰭，如背鰭、胸鰭和腹鰭; II類斑馬紋鰭，如臀鰭和尾鰭。總體上與其他鯉科魚類[1](如鯽魚)的鰭上色素細胞數量表現出從近體端到遠體端逐漸減少變化的特點截然不同。斑馬魚體側上鱗片形態與尾鰭基部鱗片相似，其色素細胞分布與鱗片處在條紋的位置有關，銀白色或金黃色條紋上的部分為無色素細胞、少量黃色素細胞或虹彩細胞，藍條紋上三種色素細胞均有分布并且數量豐富。

圖 9 斑馬魚鱗片色素細胞的分布情況

綜上所述，AB品系斑馬魚體表有黑色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞三種類型色素細胞分布，但鰭和鱗片在色素細胞組成和分布上存在著差異，鱗片中色素細胞的種類和形態特征較鰭中色素細胞更豐富。

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Microscopical Observation on Pigment Cells in Fins and Scales of Zebrafish

LIN Jin-xing, FENG Li-ping, HU Jian-hua, GAO Cheng
(Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo observe the composition, distribution and morphological characteristics of pigment cells in the fins and scales of zebrafish. Method The microstructure of pigment cells in the fins and scales of AB strain of zebrafish was observed by optical microscope.ResultsAll fins in zebrafish distributed melanophores and xanthophores, without iridophores. According to the distribution of the pigment cells, the zebrafish fins were divided into two types: with or without zebra stripes. There were melanophores, xanthophores and iridophores existed in scales. The melanophores were mainly divided into two types: type I was larger, obviously dendritic and light color; type II was smaller, nodular, dark color. Xanthophores were the smallest, yellow or orange yellow. Iridophores were a long rod like or fusiform, with smallest number.ConclusionThere were three types of pigment cells in the surface of zebrafish including melanophores, xanthophores and iridophores. The composition and distribution of pigment cells in the fins and scales were different. The types and morphological characteristics of pigment cells in the scales were more abundant than that in fins.

Zebrafish; Fin; Scale; Pigment cell; Melanophore; Xanthophore; Iridophore

Q954.5

A

1674-5817(2017)02-0094-08

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.003

2016-10-31

上海市科技發展基金實驗動物研究項目(15140901000, 16140904300)

林金杏(1983-), 女, 博士, 副研究員, 研究方向: 實驗用魚質量控制及形態學研究。

E-mail: linjinxing83@163.com