4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑對甲型肝炎減毒活疫苗誘導小鼠體液免疫應答的影響

馬 靜, 王海漩, 李思瑾, 何 慧, 胡凝珠, 胡云章

(1. 昆明醫科大學, 昆明650500; 2. 中國醫學科學院 北京協和醫學院醫學生物學研究所 云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室, 昆明 650118)

4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑對甲型肝炎減毒活疫苗誘導小鼠體液免疫應答的影響

馬 靜1,2, 王海漩2, 李思瑾2, 何 慧2, 胡凝珠2, 胡云章2

(1. 昆明醫科大學, 昆明650500; 2. 中國醫學科學院 北京協和醫學院醫學生物學研究所 云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室, 昆明 650118)

目的 研究4-苯基咪唑(4-PI)+氫氧化鋁[Al(OH)3]復合佐劑對甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l)誘導的小鼠體液免疫應答的影響。方法 實驗設置7個分組，分別是: 陰性對照組(1×PBS)，鋁佐劑組[HepA-l+Al(OH)3], 疫苗組(HepA-l), M1[HepA-l+Al(OH)3+4-PI 500 μg]組，M2[HepA-l+Al(OH)3+ 4-PI 1 mg]組，M3[HepA-l+Al(OH)3+4-PI 1.5 mg]組和M4(HepA-l+4-PI 1 mg)組, 200 μL HepA-l, 24 μL Al(OH)3，隨機分配小鼠，7只/組，分別皮下注射300 μL，接種一次。用間接酶聯免疫吸附法測試抗-甲型肝炎病毒(HAV) IgG抗體滴度，檢測時間為免疫后4周、8周、12周、16周。實驗過程中, 觀察和記錄小鼠的健康情況。結果 除陰性對照組, 其余各組4個時間點均檢測到抗-HAV IgG抗體，12周達到峰值。M2組在整個檢測階段抗體水平最高，顯著高于疫苗組(t=4.449、3.633、2.565、6.809，P＜0.05)和M4組(t=6.256、4.796、4.153、4.113，P＜0.05)，且第4周高于鋁佐組(t=2.877, P＜0.05); M4組在4個時間點檢測到的抗體水平與疫苗組相當。4-PI最佳劑量組是1 mg/只。實驗全程觀察到小鼠每項生理指標均正常。結論 4-PI+氫氧化鋁復合佐劑能增強HepA-l誘導的小鼠體液免疫應答，有望開發成HepA-l新型復合佐劑。

4-苯基咪唑(4-PI); 氫氧化鋁; 佐劑; 甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l); 體液免疫

4-苯基咪唑(4-Phenylimidazole, 4-PI, 結構如圖1)是一種類白色-淡黃色粉末化合物，生物化學中血紅素的配體, 常用于合成、篩選小分子酶制劑。1989年Sono等[1]研究表明, 它可以與吲哚胺-2,3雙加氧酶(Indoleamin-2,3 dioxygenase, IDO, 1.13.11.52)活性部位的血鐵紅素結合，降低該酶活性，是IDO較弱的非競爭性抑制劑。

吲哚胺-2,3雙加氧酶存在于人、動物肝臟外組織中, 主要表達在抗原提呈細胞(APC)、樹突狀細胞(DC)上, 催化色氨酸分解成犬尿酸代謝產物[2]，是重要的免疫反饋調節分子。炎癥環境中，IDO被脂多糖(LPS)、γ干擾素(INF-γ)誘導過表達，大量分解色氨酸, 使效應T細胞停止增殖、分化[3,4], 阻止促炎癥因子白介素-6釋放, 誘導細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(CTLA4)對特異性抗原無應答反應[5,6],增強輔助調節性T細胞(Treg)作用[7]，介導免疫抑制。研究表明, IDO可能與肝炎病毒復制、肝細胞損傷程度、肝癌復發轉移密切相關[8,9]，甚至影響肝炎疫苗的接種效果[10]。慢性乙型肝炎、丙型肝炎患者肝臟中IDO的表達大幅上升[11]，乙型肝炎病毒(HBV)感染者體內IDO mRNA量、蛋白量及活性與病毒載量呈正相關，與特異性T細胞數呈負相關。T細胞增殖被抑制，病毒逐漸擴散、感染向慢性化發展[12]。IDO還抑制肝炎小鼠自然殺傷(NK)細胞和巨噬細胞觸發的過激免疫應答[13], 敲除該基因，小鼠產生了針對HBV表面抗原的特異性細胞毒性T細胞[14]。其抑制劑1-甲基色氨酸(1-MT)能促進機體對丙型肝炎病毒的免疫應答，改善肝臟的炎癥和纖維化[15]。1-MT同樣能降低HBV感染小鼠體內IDO的活性，恢復T細胞活化增殖，減輕肝臟損傷[16]。以上研究說明IDO參與肝炎疾病的發展過程，抑制該酶活性有助于治愈這類疾病，促進疫苗的接種，IDO抑制劑具有佐劑的研究價值，有望成為肝炎控制與治療的新方法。

圖 1 4-PI結構圖Figure 1 Structure of 4-phenylimidazole

4-PI(IC50=48 μmol/L)結構簡單易合成、溶解，價格便宜安全性好。2006年Sugimoto等[17]提出IDO三維晶體結構圖,揭示4-PI非競爭性地結合IDO, 減少色氨酸分解, 恢復T細胞增殖分化的作用原理。研究者[18,19]通過不斷修飾4-PI, 證明該類化合物能有效降低IDO活性，可將其與Al(OH)3聯合,探究在HepA-l中的佐劑效果。本實驗用甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l)、Al(OH)3和不同劑量4-PI三者混合免疫小鼠, 分析4-PI+Al(OH)3復合物對小鼠體液免疫應答的影響, 以此評價該復合物的佐劑效果。

1 材料與方法

1.1 疫苗和抗原

昆明醫學生物學研究所提供HepA-l，其甲型肝炎病毒(HAV)抗原滴度為256 EU/mL和甲型肝炎抗原，為純化的甲型肝炎病毒顆粒。

1.2 實驗動物

清潔級雌性ICR小鼠共49只, 5～7周齡, 體質量18～22 g, 由昆明醫學生物學研究所小動物試驗部提供[SCXK(滇)K2014-0002]。實行的全部實驗流程嚴格遵照昆明醫學生物學研究所動物實驗倫理委員會的要求。并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.3 主要試劑

ELISA Kit(抗小鼠ABT System)購自美國KPL公司; 4-PI購自西格瑪奧德里上海貿易有限公司(CAS號: 670-95-1); 鋁佐劑[Al(OH)3膠體, 12.5 mg/mL]由昆明醫學生物學研究所提供。

1.4 方法

1.4.1 1×PBS溶液配制 電子天平稱取0.2 g KCl、8 g NaCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4, 800 mL蒸餾水溶解, 鹽酸調節pH至7.4, 蒸餾水定容至1 L，高壓滅菌20 min，室溫保存。實驗中各組的緩沖體系均用1×PBS。

1.4.2 動物分組及免疫 49只ICR雌性小鼠隨機分作7組, 7只/組。將4-PI 500 μg、1 mg、1.5 mg分別與HepA-l(200 μL)、Al(OH)3(24 μL)混合, 設置為M1、M2、M3組, 同時將4-PI 1 mg與HepA-l (200 μL)混合設置為M4組，陰性組(1×PBS)、鋁佐組[HepA-l+ Al(OH)3]、疫苗組(HepA-l)作為對照，每只小鼠皮下注射300 μL。于免疫后4周、8周、12周、16周采取小鼠尾靜脈血約100 μL/只，鼠血37 ℃放置50 min，4 ℃靜置3 h后分離血清，待檢測抗體滴度。

1.4.3 ELISA試劑盒測試抗體水平 按操作說明，用間接酶聯免疫吸附法測試特異性抗-HAV IgG抗體滴度。第一步包被抗原: 1×包被液混合甲型肝炎抗原包被96孔板, 100 μL/孔，4 ℃冰箱放置過夜;第二步封閉: 1×小牛血清(BSA)封閉, 200 μL/孔，37 ℃孵箱放置1 h; 第三步加一抗: 1×洗液洗板3次, 間隔5 min浸泡/次，洗板結束，加入倍比稀釋的各組小鼠血清，100 μL/孔，37 ℃孵箱孵育1 h; 第四步加二抗：重復洗板3次后，每孔加100 μL用辣根過氧化酶標記、1×BSA按1∶400稀釋的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵箱孵育1 h; 第五步顯色: 1×洗液重復洗板3次后, 加四甲基聯苯胺(TMB)顯色10 min，顯色液100 μL/孔; 第六步終止: 2 mol/L硫酸終止顯色, 100 μL /孔; 第七步定量檢測: 用雙波長法在酶標儀405和655 nm波長處測試每孔吸光度(A)值, 待測血清的抗體效價是出現陽性反應的最大稀釋度, 根據ELISA結果對組內每只小鼠的滴度取幾何平均數, 數據用Log10的形式表示。

1.5 安全性試驗

在實驗期內，觀察和記錄小鼠的體質量、飲食、毛色是否有變化，注射部位有無病變發生。

1.6 統計分析

利用Graphpad prism 5軟件分析數據的差異性,兩組之間進行t檢驗, P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抗體水平檢測

除1×PBS免疫的小鼠, 其它各組均檢測到抗-HAV IgG抗體, 且都呈先上升后下降的趨勢, 最大值在第12周達到。4周、8周、16周, M1組的抗體水平比疫苗組高(t=3.225、2.513、3.782, P＜0.05), 4周、12周比M4組高(t=5.326、4.4, P＜0.05)。M2組在每個檢測時間段，檢測到的抗體滴度均最高，與疫苗組(t=4.449、3.633、2.565、6.809, P＜0.05)和M4組(t=6.256、4.796、4.153、4.113, P＜0.05)比較, 差異都有統計學意義; 和鋁佐組對比, 抗體滴度的差異在第4周有統計學意義(t=2.877, P＜0.05)。16周M3與疫苗組小鼠IgG水平比較差異有統計學意義(t=2.529, P＜0.05), 12周M3組抗體水平比M4組高(t=4.477, P＜0.05)。M4組檢測全程抗體水平與疫苗組相當。鋁佐組抗體滴度比M4組和疫苗組高(t=3.956、2.313/2.355、4.279, P＜0.05), 有統計學差異的時間在第12周、16周(圖2)。4-PI 1 mg/只是目前動物實驗中體液免疫增強效果最佳的劑量。

2.2 安全性評價

實驗過程中，每只小鼠體質量、毛色、飲食沒有異常變化，未發生痙攣、水腫、休克等病理現象，注射部位無結節、紅腫。說明4-PI在目前實驗劑量下較為安全。

圖 2 4個檢測時間點每組血清抗-HAV IgG水平Figure 2 Anti-HAV IgGs in serum of each group at four detecting time points

3 討論

傳統佐劑利用協同抗原進一步激發機體炎癥反應，作為參與免疫應答中某些受體分子的激動劑，是內源危險信號因子等機制從正面改善新型疫苗在免疫原性、靶向性上的缺陷[20], 促進人體的免疫應答水平，但效果不夠明顯, 且副作用較多。鋁佐劑是現今使用最廣泛的佐劑，可用于人，安全、低成本，但誘導的黏膜反應、細胞免疫應答不足，且注射部位易引起結節、紅腫[21]。IDO的發現，為新型佐劑的研發帶了新的思路，它增強肝炎病毒復制，加劇肝細胞損傷，抑制T細胞免疫功能[15],還介導腫瘤免疫逃逸[22], 因此其抑制劑不僅用于提高免疫接種及化學治療的療效[23]，還被廣泛用在腫瘤免疫治療[24]。IDO抑制劑聯合Al(OH)3, 可以從免疫調節的正反兩方面，提高機體的免疫應答水平。

本實驗將不同劑量IDO抑制劑4-PI與HepA-l、Al(OH)3混合免疫小鼠，探討4-PI+Al(OH)3復合物對小鼠體液免疫的影響。實驗結果表明，復合佐劑各組小鼠抗體水平明顯提高，且均能持續一段時間，M2組在整個實驗過程中產生的抗體水平最高，高于鋁佐組，安全性良好。單純4-PI M4組抗體水平與抗原組相當，免疫增強作用不夠顯著，可能與其抑制力弱，實驗樣本量少有關，需增設單一4-PI、復合佐劑更多劑量分組，增加HepA-l用量或改變免疫方式等來進一步判斷4-PI的佐劑效應和復合佐劑能否替代鋁佐劑; M4組抗體水平較鋁佐組降低快，可初步說明4-PI免疫刺激持續時間比Al(OH)3短，原因是4-PI降低IDO活性短時快速，Al(OH)3則通過倉儲效應緩慢釋放抗原, 產生持續免疫刺激。該判斷會在后續實驗中進一步驗證。根據昆明醫學生物學研究所王陳蕓等[25]研究, 用本所提供的HepA-l皮下免疫小鼠后在4周、8周、12周、16周4個檢測時間點，正常抗體效價變化規律為:抗體水平隨時間延長逐漸升高, 于第8周達到峰值,維持較長時間后逐漸下降。龍潤鄉等[26]用聚乳酸/乙醇酸包裹HepA-l口服免疫獼猴，第3周檢測到抗-HAV IgG, 5～6周達到峰值，隨后逐漸下降，15周加強免疫一次后，抗體水平回升。兩實驗中抗-HAV IgG效價變化的差異與動物模型、免疫方式、HepA-l用量有關。本實驗各組抗體效價變化趨勢和前人的研究一致，最大值在12周達到，并能維持一定時間。后續將重復實驗、增加檢測時間點進一步說明抗體效價的變化趨勢。

實驗組抗體水平的變化初步證明4-PI+Al(OH)3復合佐劑的有效性, 其作用機制可解釋為在HepA-l誘導的炎癥環境中，Al(OH)3緩慢釋放抗原，持續刺激免疫，4-PI不斷降低IDO對免疫的抑制，二者結合從正反兩面增強體液免疫應答，提高抗體水平。研究發現在4-PI苯環2位連接一個羥基(-OH)，或3位、4位分別連接一個巰基(-SH)，合成的衍生物對IDO的抑制能力明顯增加[18]。后續實驗將在繼續驗證該復合物增強免疫有效性、單一4-PI佐劑效應的基礎上，嘗試檢測抑制力更強、更安全的4-PI衍生物+Al(OH)3復合物的佐劑效果，探討該類復合佐劑增強免疫的機制，期望能篩選出更安全有效的疫苗佐劑。

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Impact of 4-Phenylimidazole Combined with Aluminum Hydroxide on Humoral Immune Response Induced by Hepatitis A Virus Attenuated Live Vaccine in Mice

MA Jing1,2,WANG Hai-xuan2, LI Si-jin2, HE Hui2, HU Ning-zhu2, HU Yun-zhang2
(1. Kunming Medical University, Kunming 650500, China; 2. Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Prevention & Control Research on Insect-Borne Infectious Diseases, Kunming 650118, China)

ObjectiveTo investigate the impact of 4-phenylimidazole(4-PI) combining with aluminum hydroxide as an immunological adjuvant on humoral immune response in mice immunized with live hepatitis A virus (HAV) attenuated live vaccine (HepA-1).MethodsSeven experiment groups are set up, with 7 ICR mice per group randomly. Use 1×phosphate buffer saline as negative control group, aluminum adjuvant group (HepA-1 200 μL+Al(OH)324 μL), antigen group (HepA-1), M4 (HepA-1+4-PI 1 mg) as control, in which mice were injected subcutaneously with 300 μL, immunizing one time. The mice of three groups (M1, M2, M3) were immunized with live hepatitis A vaccine HepA-1 mixed with aluminum hydroxide,4-PI at concentrations of 500 μg, 1 mg, 1.5 mg respectively. The anti-HAV specific IgG antibody levels were tested by indirect ELISA method in the serum of mice after the first 4th, 8th, 12th, 16th week of injection. The health condition of mice were observed and record during the whole study.ResultsHAV-specific IgG levels of all mice were detected at four setting time point except negative control group and reached the maximum at 12th week. The IgG titers of group M2 mice were the highest at all detected time point and showed significant difference with those of antigen group (t=4.449, 3.633, 2.565, 6.809; P＜0.05), group M4 (t=6.256,4.796, 4.153, 4.113; P＜0.05) and aluminum group at 4th week (t=2.877, P＜0.05). The IgGs induced by group M4 was comparable to the antigen group in each test phase. The optimal dosage of 4-PI was 1 mg for each mouse. The physiological indexes in all the groups of mice was normal during the course of experiment.Conclusions The humoral immune responses induced by HepA-l in mice was heightened by 4-PI combined with aluminum hydroxide,which had potential for developing a novel and compound HepA-1 adjuvant.

4-Phenylimidazole(4-PI); Aluminum hydroxide; Adjuvant; Hepatitis A virus attenuated live vaccine (HepA-1); Humoral immune

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0102-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.004

2017-01-16

國家科技支撐計劃項目(2014BAI01B01); 云南省創新團隊“中國醫學科學院醫學生物學研究所新型疫苗佐劑應用研究省創新團隊”(2011CI140);國家自然科學基金項目(31500748); 國家重點研究計劃生物安全關鍵技術研究發重點專項(2016YFC1202300)

馬 靜(1989-), 女, 碩士研究生, 主要從事疫苗佐劑方面的研究。E-mail: 1058085414@qq.com

胡云章(1962-), 男, 教授, 博士生導師, 主要從事病毒疫苗方面的研究。

E-mail: huyunzhangym@126.com