樹鼩經甲型肝炎減毒活疫苗、乙型肝炎疫苗及聯合硫酸乙酰肝素佐劑免疫后的免疫效果評價

王東寶, 胡云章, 胡凝珠, 罕園園, 匡德宣, 李彥涵

(中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所疫苗研究室 云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室 云南省重大傳染病疫苗工程技術研究中心,云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室, 昆明650118)

樹鼩經甲型肝炎減毒活疫苗、乙型肝炎疫苗及聯合硫酸乙酰肝素佐劑免疫后的免疫效果評價

王東寶, 胡云章, 胡凝珠, 罕園園, 匡德宣, 李彥涵

(中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所疫苗研究室 云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室 云南省重大傳染病疫苗工程技術研究中心,云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室, 昆明650118)

目的 探討甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l)、乙型肝炎疫苗(Hbv)以及HepA-l、Hbv分別與佐劑硫酸乙酰肝素(HS)聯合對樹鼩進行免疫后樹鼩體液免疫應答的影響。方法 按照疫苗種類、佐劑以及免疫途徑將樹鼩隨機分組，同時設空白對照組，分別于末次免疫后的4周、8周、12周、16周和20周尾靜脈采血，用ELISA法檢測樹鼩血清中的特異性IgG抗體水平。結果 除空白對照組外，實驗組均在末次免疫的第四周檢測到抗甲型肝炎病毒(HAV)及抗乙型肝炎病毒(HBV)抗體，抗體水平隨著免疫時間延長而逐漸升高并于12周達到峰值，此后逐漸下降。同時，聯合HS佐劑組的體液免疫效果均優于單純疫苗免疫組。并且不同抗原以及聯合佐劑采用不同的免疫途徑免疫樹鼩其免疫效果存在顯著性差異。結論 通過對樹鼩進行疫苗免疫原性和增強免疫效果檢測，證實以樹鼩作為動物模型進行疫苗評價的可行性。

樹鼩; 甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l); 乙型肝炎疫苗(Hbv); 硫酸乙酰肝素(HS); 體液免疫

樹鼩(Tupaia belangeri, Tree shrew)是一種生活在熱帶和亞熱帶地區的哺乳綱攀鼩類的小型動物, 在進化過程中處于食蟲類和靈長類之間，與人類有較近的親緣關系[1,2]。由于其生理特征和解剖結構都更接近于非人靈長類動物的特點，已用于環境壓力、生殖及神經生理學以及包括單純性皰疹病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、基孔肯雅病毒等病毒感染方面的研究[3-6]。因此以樹鼩作為人類重大疾病研究的動物模型，在醫學生物學上已呈現出廣闊的應用前景[4,7-9]。

目前國內外對疫苗評價大多選用小鼠或靈長類動物模型，而以樹鼩作為動物模型對疫苗進行有效性評價卻缺乏報道，制約了樹鼩動物模型標準化的建立[10-12]。本實驗以樹鼩為動物模型，以單獨甲型肝炎減毒活疫苗(Hepatitis A virus attenuated live vaccine, HepA-l)、乙型肝炎疫苗(Hepatitis B vaccine, Hbv)以及HepA-l、Hbv分別與佐劑硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate, HS)聯合以皮下及肌肉兩種方式對樹鼩進行免疫。觀察免疫后樹鼩對疫苗及疫苗與佐劑聯合后體液免疫應答的影響，為樹鼩作為動物模型進行疫苗免疫或藥物評價提供免疫學指標，并為樹鼩標準化模型的建立完善數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級成年雄性樹鼩，體質量130～160 g，來源于中國醫學科學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心[SCXK(滇)K2013-0001]。所有相關操作均按照醫學生物學研究所動物實驗倫理委員會要求進行,動物飼養設施符合相關標準[SYXK(滇)K2014-0007]。

1.2 疫苗及抗原

甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l)，HAV抗原滴度為256 EU/mL, 由中國醫學科學院醫學生物學研究所提供; 甲型肝炎抗原(HAV顆粒), 由中國醫學科學院醫學生物學研究所提供; 重組Hbv(漢遜酵母)，規格10 μg/0.5 mL, 購自大連漢信生物制藥有限公司。

1.3 主要試劑

ELISA檢測試劑盒(Anti-Mouse ABT System)購自美國KPL公司；辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)標記的兔抗樹鼩IgG二抗由本所孫茂盛課題組提供; HS(1 mg/mL)購自美國Sigma公司。

1.4 疫苗與佐劑的使用劑量及制備

本實驗室前期以小鼠為動物模型摸索出單獨免疫HepA-l合適的使用劑量是18 EU, 單獨免疫Hbv合適的使用劑量是 5 μg, HS合適的使用劑量是100 μg[9]。將抗原與佐劑混合后，在漩渦振蕩儀上劇烈震蕩混勻, 備用。

1.5 動物分組及免疫

將成年健康雄性樹鼩按抗原種類、佐劑、免疫途徑隨機分10組，每組8只，同時設空白對照組，詳細分組情況見表1。

表 1 各組抗原佐劑含量及免疫途徑和程序Table 1 Dosages of antigen, adjuvant, immune routes and schedules of various groups

1.6 樹鼩血清抗體水平檢測

采用間接ELISA法。分別于二次免疫后的0周、4周、8周、12周、16周、20周，經樹鼩尾靜脈采血0.5 mL，分離血清，從40倍起倍比稀釋后，間接ELISA法檢測抗-HAV、抗-乙型肝炎病毒(HBV)特異性IgG水平，其中二抗為本所自備的HRP標記的兔抗樹鼩IgG二抗，其余操作按照試劑盒說明書進行。

1.7 統計學分析

應用Graphpad prism 5軟件進行統計學分析，實驗數據以±s，組間比較采用配對t 檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體液免疫結果

空白對照組樹鼩在各檢測時間點均無IgG抗體的產生，除空白對照組外，所有實驗組都在末次免疫后的4周、8周、12周、16 周產生抗-HAV IgG或抗-HBV IgG, 并且抗體水平隨著免疫時間延長而逐漸升高，于12周達到峰值，此后逐漸下降。各組樹鼩免疫后血清特異性IgG水平及各組間差異詳見圖1。

2.1.1 單獨抗原組與混合HS組體液免疫效果評價相同的免疫途徑下免疫2次后，抗原混合HS后樹鼩的抗體滴度更高，體液免疫的效果更好。其中，以皮下免疫途徑的第1組單獨免疫HepA-l組與第2組HepA-l +HS佐劑免疫組，第3組單獨免疫Hbv組與第4組Hbv+HS免疫組，以及以肌肉免疫途徑的第6組單獨免疫HepA-l組與第7組HepA-l +HS佐劑免疫組，第8組單獨免疫Hbv組與第9組Hbv+HS免疫組, 組間比較采用t檢驗, 差異具有統計學意義(P2-1=0.048 1，P4-3＜0.000 1, P7-6＜0.000 1, P9-8＜0.000 1，P均＜0.05)。結果表明，HS具有較好的免疫佐劑效應，能夠顯著增強抗原特異的體液免疫應答。

圖1 不同時間各組小鼠血清IgG水平*indicate P＜0.05,**indicate P＜0.01,***indicate P＜0.001Figure 1 IgG titers in sera of mice in different groups at different times

2.1.2 不同免疫途徑體液免疫效果評價 第1組與第6組單獨免疫HepA-l組分別以皮下和肌肉兩種免疫途徑對樹鼩進行免疫，組間比較差異具有統計學意義(P6-1=0.015 9, P＜0.05)。結果表明, 以樹鼩作為動物模型單獨免疫HepA-l皮下免疫途徑體液免疫效果更好。第2組與第7組HepA-l+HS免疫組分別以皮下和肌肉兩種免疫途徑對樹鼩進行免疫, 皮下免疫組在每個時間點的抗體滴度均高于肌肉免疫組, 但組間比較差異無統計學意義(P7-2=0.8985)。第3組和第8組單獨免疫Hbv組分別以皮下和肌肉兩種免疫途徑對樹鼩進行免疫，皮下免疫組抗體滴度均高于肌肉免疫組，但組間比較差異不具有統計學意義(P8-3=0.068 2)。第4組與第9組Hbv+HS免疫組分別以皮下和肌肉兩種免疫途徑對樹鼩進行免疫，組間比較差異具有統計學意義(P9-4=0.048 1, P＜0.05)。結果提示, 以樹鼩作為動物模型Hbv與佐劑HS聯合免疫, 皮下免疫途徑的體液免疫效果更好。

2.2 安全性評價

實驗期間各組樹鼩體質量、毛色均正常，未出現蜷縮、豎毛、搔鼻、抽搐、痙攣、水腫及休克等異常反應，各組樹鼩注射部位均未出現紅腫、結節，進食、水、糞便和精神等均正常。實驗結束樹鼩無死亡。

3 討論

非人靈長類動物與人類的關系最為密切，其在形態、生理機能和生化代謝等方面與人類接近，但由于資源珍貴，成本太高等原因使靈長類動物如猴子的應用受到很大的限制。因此，免疫學和生理學特征與靈長類動物接近的樹鼩引起學者的廣泛關注[9,13]。樹鼩體型小，易馴養，繁殖能力強，新陳代謝等生理特征和解剖結構都更接近于非人靈長類動物，存在諸多自發性疾病的特性，可以作為某些人類重大疾病研究的動物模型, 在醫學生物學上已呈現出廣闊的應用前景[14-17]。

目前國內外對于疫苗評價大多選用小鼠或者靈長類動物模型，各種檢測技術都比較成熟，但目前還尚未有樹鼩作為動物模型進行疫苗安全性和有效性評價的相關報道。

本實驗對樹鼩進行HepA-l疫苗、Hbv疫苗及聯合HS佐劑免疫后的免疫效果評價，并對皮下和肌肉兩種免疫途徑的免疫效果進行比較。研究結果表明除空白對照組外，其余組均在末次免疫的第4周檢測到抗-HAV及抗-HBV抗體，并且抗體水平隨著免疫時間延長而逐漸升高，于第12周達到峰值, 此后逐漸下降。說明以樹鼩作為動物模型進行疫苗檢測是可行的，樹鼩可以對疫苗產生良好的免疫應答, 體液免疫效果復合研究預期。HS是一類廣泛分布于細胞外基質的糖胺聚糖，當細胞外基質發生炎癥或損傷時, 降解為可溶性低分子量HS[18,19]。文獻報道[20]，HS作為免疫佐劑能增強以小鼠為動物模型的體液免疫應答，并且對于以HBV亞單位為抗原的體液免疫增強效應優于鋁佐劑或與鋁佐劑相當。本實驗對疫苗聯合HS佐劑的體液免疫效果進行檢測，結果表明聯合HS佐劑組的體液免疫效果均優于單純疫苗免疫組，統計學分析具有顯著性差異，說明HS具有的免疫佐劑效應能夠顯著增強以樹鼩為動物模型的抗原特異的體液免疫應答。同時，本實驗還對不同免疫途徑的免疫效果進行了比較。數據分析顯示，單獨HepA-l組以及Hbv聯合HS組皮下免疫的體液免疫效果顯著優于肌肉免疫的體液免疫效果，單獨Hbv組以及HepA-l組聯合HS組皮下免疫的抗體滴度雖然在每一個檢測點都高于肌肉免疫組的抗體滴度，但統計學分析不具有顯著性差異。結果表明，以樹鼩作為動物模型，免疫途徑的選擇需要更為慎重，不同的抗原免疫需要摸索不同免疫途徑，甄選出適合該抗原的最佳免疫途徑才能獲得滿意的免疫效果。

綜上所述，本實驗通過對樹鼩進行疫苗免疫原性和增強免疫效果的檢測，初步了解其在免疫學方面的特點，證實了以樹鼩作為動物模型進行疫苗評價的可行性，不僅為以后疫苗及藥物評估平臺建設提供基礎數據，同時也為樹鼩種質資源的開發奠定堅實的基礎。

[1] Yang C, Ruan P, Ou C, et al. Chronic hepatitis B virus infection and occurrence of hepatocellular carcinoma in tree shrews (Tupaia belangeri chinensis)[J]. Virol J, 2015, 12:26.

[2] Li SA, LEE WH, Zhang Y. Two bacterial infection models in tree shrew for evaluating the efficacy of antimicrobial agents [J]. Zool Res, 2012, 33(1):1-6.

[3] Tong Y, Zhu Y, Xia Y, et al. Tupaia CD81, SR-BI, claudin, and occludin support hepatitis C virus infection [J]. Virol J, 2011, 85(6):2793-2802.

[4] 黃曉燕, 徐娟, 孫曉梅, 等. 樹鼩在人類疾病動物模型中應用研究進展[J], 實驗動物科學, 2013, 30(2):59-64.

[5] Bukh J, Lanford RE, Purcell RH. Persistent human hepatitis B virus infection in cynomolgus monkeys:a novel animal model in the search for a cure [J]. Hepatology, 2013, 58(5): 1533-1536.

[6] Wang Q, Schwarzenberger P, Yang F, et al. Experimental chronic hepatitis B infection of neonatal tree shrews (Tupaia belangeri chinensis): a model to study molecular causes for susceptibility and disease progression to chronic hepatitis in humans[J]. Virol J, 2012, 9:170.

[7] 嚴瑞琪, 蘇建家, 陳志英, 等. 人乙型肝炎病毒實驗感染成年樹鼩的初步研究[J]. 廣西醫學院學報, 1984, 1(1):10-15.

[8] Wang BJ, Tian YJ, Meng ZJ, et al. Establishing a new animal model for hepadnaviral infection: susceptibility of Chinese Marmota species to woodchuck hepatitis virus infection [J]. Gen Virol, 2011,92(3):681-691.

[9] He W, Ren B, Mao F, et al. Hepatitis D virus infection of mice expressing human sodium taurocholate co-transporting polypeptide[J]. PLoS Pathog, 2015, 11(4):e1004840.

[10] Bility MT, Cheng L, Zhang Z, et al. Hepatitis B virus infection and immunopathogenesis in a humanized mouse model: induction of human-specific liver fibrosis and M2-like macrophages[J]. PLoS Pathog, 2014, 10(3):e1004032.

[11] Walter E, Keist R, Niederost B, et al. Hepatitis infection of tupaia hepatocytes in vitro and in vivo[J]. Hepatology, 1996, 24(1):1-5.

[12] Fan Y, Huang ZY, Cao CC, et al. Genome of the Chinese tree shrew [J]. Nat Commun, 2013, 4:1426.

[13] Fan Y, Yu D, Yao YG. Tree shrew database (Tree shrew DB): agenomic knowledge base for the Chinese tree shrew[J]. Sci Rep, 2014, 4:7145.

[14] 李海燕, 黎家敏, 李靖瀟, 等. 高糖高脂飼料聯合地塞米松誘發樹鼩血糖、血脂異常[J]. 實驗動物與比較醫學, 2010, 30(3):197-200.

[15] Meng BH, Liu H, Liang Y, et al. Investigation of pathogenesis of diabetic myopathy of skeletal muscle in experimental type I diabetes mellitus of tree shrews[J]. Chin J Diabetes, 2005, 13(4):290-292.

[16] 江勤芳, 匡德宣, 仝品芬, 等. 樹鼩規模化繁殖及繁殖群建立[J]. 實驗動物科學, 2010, 28(6):35-38.

[17] 蘭蕓, 王海漩, 烏美妮, 等. 內源性危險信號低分子量硫酸乙酰肝素的免疫佐劑作用[J]. 中國生物制品學雜志, 2011, 24(1):5-9.

[18] 施建東, 胡凝珠, 趙蕊蕊, 等. 氫氧化鋅與低分子量透明質酸復合佐劑對甲肝乙肝聯合抗原的體液免疫增強作用[J].中國生物制品學雜志, 2012, 25(1):34-36.

[19]梁亮, 李媛, 岳慧芬, 等. 用人工繁殖的圍生期和幼年期樹鼩感染人乙型肝炎病毒的初步研究[J]. 中國人獸共患病學報, 2006, 22(8):792-795.

[20] Powell JD, Horton MR. Threat matrix: low-molecular-weight hyaluronan（HA）as a danger signal[J]. Immunol Res, 2005, 31(3):207-218.

The Immunity Effect Evluation on Tree Shrew by Hepatitis A Virus Attenuated Live Vaccine, Hepatitis B Vaccine Independently or Combined Adjuvant Heparan Sulfate

WANG Dong-bao, HU Yun-zhang, HU Ning-zhu, HAN Yuan-yuan, KUANG De-xuan, LI Yan-han
(Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical College and Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research & Development on Severe Infectious Diseases, Yunnan Research Center of Engineering Technique for Vaccines against Severe Infectious Diseases, Yunnan Key Laboratory of Prevention & Control Research on Insect-Borne Infectious Diseases, Kunming 650118, China)

ObjectiveTo investigate the humoral immune response of tree shrew after the immunization of Hepatitis A attenuated live vaccine (HepA-l)、Hepatitis B vaccine (Hbv) independently and combined with adjuvant heparan sulfate (HS).MethodsThe tree shrews were randomly divided into 10 groups by the type of vaccine, adjuvant and schedules. The specific IgG levels in sera of tree shrew were determined by ELISA at 4, 8, 12, 16 and 20 weeks after the last immunization respectively.ResultsExcept the blank control group, the anti - hepatitis A virus (HAV) and anti - hepatitis B virus (HBV) antibody was detected in all the experimental group at 4 weeks after last immunization, the level of immune antibody were gradually increased with time and reached the peak at the 12 weeks, then decreased gradually. At the same time, the humoral immunity effect of HS adjuvant group were better than that of vaccine group. There is a significant difference on immunity among tree shrews with different antigens and adjuvant by different immunization schedules.ConclusionThe immune effect of vaccine immunogenicity and immune enhancing effect on tree shrew confirms the feasibility of the tree shrew as an animal model.

Tree shrew; Hepatitis A virus attenuated live vaccine (HepA-l); Hepatitis B vaccine (Hbv); Heparan sulfate (HS); Humoral immunity

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0113-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.006

2017-01-16

國家科技支撐計劃項目(2014BAI01B01); 國家重點研究計劃生物安全關鍵技術研究發重點專項(2016YFC1202300)

王東寶(1975-), 男, 主管技師, 研究方向: 生物制品開發。E-mail: 285209690@qq.com

李彥涵(1982-), 女, 碩士, 助理研究員, 研究方向: 疫苗研發。E-mail: 110393273@qq.com