重癥手足口病患兒血清S100B和NSE水平與T淋巴細胞亞群的相關性研究

韋祎+梁薇+黃月艷+唐漢慶+李曉華+李清鋒+謝毅強+謝躍琦+溫曉梅

【摘要】目的觀察重癥手足口病（HFMD）患兒血清星形膠質源性蛋白（S100B）和神經元特異性烯醇化酶（NSE）水平與T淋巴細胞亞群的變化及相關性，并討論其臨床價值。方法選取2015年1～9月收治的HFMD患兒156例，包括普通病例80例（普通組），重癥病例76例（重癥組），另外選取70例健康幼兒作為對照組。采用流式細胞技術檢測外周血T淋巴細胞亞群，采用ELISA法檢測血清S100B和NSE水平，并分析血清S100B和NSE水平與T淋巴細胞亞群的相關性。結果與對照組比較，普通組和重癥組T淋巴細胞總數、CD4+、CD8+、CD4+ /CD8+均降低，且重癥組降低更加明顯（P<0.01）。與對照組和普通組比較，重癥組血清S100B水平（1.64±0.28）μg/L和NSE水平（5283±4.68）ng/ml均升高（P<0.01）。重癥組血清S100B和NSE水平與T淋巴細胞亞群呈負相關（P<0.01）。結論T淋巴細胞亞群和血清S100B、NSE水平指標組合對于重癥手足口病的早期識別具有一定的參考價值。

【關鍵詞】手足口病；T淋巴細胞亞群；星形膠質源性蛋白；神經元特異性烯醇化酶

中圖分類號：R512.5文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.05.005

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation of the serum levels of S100B，NSE and Tlymphocyte subsets in children with severe handfootmouth disease （HFMD） and discuss their clinical value.MethodsA total of 156 children with HFMD admitted to hospital from January to September，2015 were collected and divided into general group （80 cases） and severe group （76 cases），70 healthy children were selected as control group.Changes of peripheral blood Tlymphocyte subsets were examined by flow cytometry and the serum levels of S100B and NSE were detected by ELISA.In addition，the correlation of the serum levels of S100B，NSE and Tlymphocyte subsets was discussed.ResultsCompared with the control group，total amount of T lymphocyte，CD4+，CD8+ and CD4+/CD8+ of both the general group and the severe group all decreased，and those of the severe group decreased more significantly（P<0.01）.Compared with the control group and the general group，both the serum level of S100B（1.64±0.28）μg/L and the serum level of NSE（52.83±4.68）ng/ml in the severe group all increased（P<0.01）.The levels of serum S100B and NSE were negatively correlated with T lymphocyte subsets in the severe group（P<0.01）.ConclusionCombination of Tlymphocyte subsets and the serum levels of S100B and NSE can provide definite reference value in the early identification of severe HFMD.

【Key words】HFMD；Tlymphocyte subsets；S100B； NSE

手足口病（handfootmouth disease，HFMD）是兒科常見傳染病，臨床表現輕重不同，具有傳播較快、傳染性較強的特點。輕型以手、足、口腔、臀部出現斑丘疹、皰疹體征為主，而重癥型多累及神經系統，出現腦炎、無菌性腦脊髓膜炎等腦損傷病變。重癥型患兒病情進展快，由于對重癥型辨別主要靠臨床癥狀，當出現腦損傷表現時，病情往往已很嚴重，臨床治療難度增大，病死率高。因此，早期辨識重癥型值得探討。HFMD由腸道病毒感染所致，常見的病毒如腸道病毒71型（EV71）及柯薩奇病毒A16型（CoxA16）。研究表明病毒感染后，T淋巴細胞激活引起的免疫應答在HFMD發病機制中起著重要作用[1，2]，而血清星形膠質源性蛋白（S100B）和神經元特異性烯醇化酶（NSE）水平是反映腦損傷程度的靈敏指標[3]。本研究通過檢測重癥HFMD患兒外周血T淋巴細胞亞群和血清S100B、NSE水平變化并探討其相關性，為重癥HFMD的早期識別提供組合參考指標。

1對象與方法1.1研究對象選取2015年1月至9月在兒科收治住院診斷為HFMD的患兒156例為研究對象。普通病例組（普通組）80例，男48例，女32例；年齡8個月～8歲，平均（2.45±0.72）歲。重癥病例組（重癥組）76例，男40例，女36例；年齡9個月～10歲，平均（3.11±1.02）歲。另外選取經過健康體檢中心體檢的健康幼兒70例作為對照組，其中男40例，女30例，年齡10個月～9歲，平均（3.26±1.15）歲。本研究獲得醫院倫理委員會和患兒監護人書面知情同意。

1.2入選及排除標準依據衛生部手足口病臨床專家組研究制定的《手足口病診療指南（2010年版）》診斷標準以及《腸道病毒71型感染重癥病例臨床救治專家共識（2011）》[4]。普通病例：急性起病，發熱，口腔黏膜出現散在皰疹，手、足、臀部出現斑丘疹、皰疹，皰疹周圍出現炎性紅暈，皰內液體較少，可伴有咳嗽、流涕、食欲不振等癥狀，部分病例僅表現為皮疹或皰疹性咽峽炎。重癥病例：神經系統受累表現為精神差、嗜睡、頭痛、易驚、譫妄、昏迷；肢體抖動、肌陣攣、共濟失調、眼球震顫；無力或急性遲緩性麻痹；驚厥；查體可見腦膜刺激征；腱反射減弱或消失。呼吸系統受累表現為呼吸淺促、呼吸困難或節律改變，紫紺、血性泡沫樣痰、肺部濕啰音或痰鳴音。循環系統受累表現為面色蒼白或灰白、四肢發涼、指（趾）發紺、脈搏淺速等。排除標準：（1）有腦發育不良、結核感染者；（2）近1個月有呼吸道等感染病史；（3）顱腦外傷性損傷，遺傳性免疫性疾病，合并嚴重心、肝、腎等系統疾病。

1.3血清S100B和NSE水平檢測無菌非抗凝管空腹采集各組新鮮外周血2 ml，4℃ 1000 r/min離心10 min，吸取血清，每管50 μL分裝于EP管中，置-70℃冰箱保存待檢。采用雙抗體夾心ELISA法測定血清S100B、NSE水平，在酶標儀450 nm波長測各孔的OD值，與標準曲線比較并計算相應樣品的濃度。操作嚴格按照試劑盒說明書進行，試劑盒由北京生物科技有限公司提供。

1.4T淋巴細胞亞群檢測各組空腹抽取靜脈血2 ml，置于EDTA抗凝管。管中依次加入 CD4+Ftc、CD8+pe、CD3+Percp三色抗體各10 μL，室溫避光孵育25 min，每管加入200 μL溶血素，輕輕吹打，在室溫下避光靜置 15 min，裂解紅細胞；觀察溶液澄清透明后，加入預冷 PBS 液1 ml，室溫下3000 r/min離心10 min，去上清，加入1 ml PBS液搖勻，滴加1%多聚甲醛液100 μL固定，上流式細胞儀檢測外周血T淋巴細胞亞群。所有抗體由北京生物科技有限公司提供。

1.5統計學方法采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用LSDt檢驗，相關性分析采用Pearson檢驗，檢驗水準：α=0.05。

2結果2.1各組血清S100B和NSE水平比較與對照組比較，重癥組血清S100B和NSE水平均升高，差異有統計學意義（均P<0.01）；與普通組比較，重癥組血清S100B和NSE水平均升高，差異有統計學意義（均P<0.01）。見表1。

2.2各組T淋巴細胞亞群檢測結果比較與對照組比較，普通組和重癥組T淋巴細胞總數、CD4+百分比、CD8+百分比、CD4+/CD8+比值均降低，差異均有統計學意義（均P<0.01），以重癥組降低明顯。見表2。

2.3血清S100B和NSE水平與T淋巴細胞亞群相關性Pearson相關分析結果表明，重癥組血清S100B和NSE水平與T淋巴細胞亞群呈負相關（均P<0.01）。見表3。

3討論HFMD主要致病原是腸道病毒EV71以及CoxA16，是兒科急性傳染病，分為普通型和重型、危重型。重型和危重型屬于重癥HFMD，進展快，病死率高。早期對重癥HFMD實施干預措施，能防止其惡性進展，眾多臨床實踐已經表明干預越早，效果越好。對于重癥HFMD的早期診斷，相關血清學指標或敏感參照物的選擇尚未達成共識，有研究[5]通過動態監測D二聚體水平可為危重型HFMD的危險度分層、病情嚴重程度的預測及預后評估提供血清學指標的參考。另外有研究[6]觀察危重型HFMD在有神經系統受累癥狀體征基礎上，通過分析基礎生命體征包括體溫、心率、呼吸頻率、血壓的變化，以期對危重型HFMD的早期識別提供有價值的參考。鑒于目前對重癥HFMD的臨床診斷主要依靠癥狀體征、顱腦影像學檢查，存在一定的滯后性，因此，如何早期辨識重癥HFMD值得探討。本研究通過檢測HFMD血清S100B和NSE水平及T淋巴細胞亞群的變化并觀察其相關性，從血清學指標和免疫功能變化角度為早期識別重癥HFMD提供思路，以供同仁討論。

T淋巴細胞在免疫應答中起著重要作用，根據表型的不同分為CD4+細胞和CD8+細胞亞群，其中的CD4+細胞作為免疫輔助性細胞，功能上主要與促進體液免疫和細胞免疫相聯系，而CD8+是細胞毒性細胞或抑制性細胞，功能上是抑制免疫應答[7]，生理情況下，CD4+細胞數量、CD8+細胞數量維持穩定以及CD4+/CD8+比值保持在一個平衡狀態，使機體免疫功能處于與內外環境相適應狀態。因此，通過檢測T淋巴細胞亞群可以了解機體的免疫功能，對于免疫性疾病的發生發展和預后具有重要的臨床參考價值[8]。

腸道病毒EV71以及CoxA16感染人體后，人體抗病毒感染的免疫應答啟動，T淋巴細胞亞群變化可以反映機體免疫功能，在本實驗工作中，我們注意到普通組和重癥組T淋巴細胞總數、CD4+百分比、CD8+百分比、CD4+/CD8+比值均降低，而以重癥組降低明顯，提示T淋巴細胞亞群變化有作為較早識別重癥HFMD的潛在性。

S100B主要存在于中樞神經系統的星狀膠質細胞，NSE主要存在于神經元和神經內分泌細胞中，重癥HFMD主要表現為中樞神經系統受累，意味著腦組織在不同程度上受損，由于病毒感染、免疫應答傷害或繼之引起的炎癥損害等都可能損傷腦神經元和血腦屏障，導致S100B和NSE進入血液或腦脊液，引起其水平升高[9，10]，這一改變先于重癥HFMD臨床表現和相關影像學檢查出現，是反映腦損傷程度的靈敏指標。

T淋巴細胞亞群在機體的免疫方面發揮著重要的免疫調節和免疫作用，對病毒的清除以及疾病的轉歸有重要影響。若T淋巴細胞總數或相關亞群數量下降則提示其功能低下，對病毒清除能力減弱，則病毒感染對腦神經元造成的損害越大，表現為血液中S100B和NSE水平持續升高，因此，S100B和NSE水平與T淋巴細胞亞群在病毒感染損傷與抗病毒感染能力之間產生了聯系，這樣就為綜合S100B、NSE水平與T淋巴細胞亞群以推知HFMD的病情或預后提供了途徑。

在本實驗中，普通組血清S100B和NSE水平雖比對照組有升高，但差異不大，而重癥組與普通組、對照組比較，重癥組血清S100B和NSE水平升高，差異明顯，提示病毒感染早期，重癥HFMD在血清S100B和NSE水平上即可表現出與普通組和對照組的顯著差別，而且，血清S100B和NSE水平與T淋巴細胞亞群的相關性顯示，重癥組血清S100B和NSE水平與T淋巴細胞亞群呈負相關，表明重癥HFMD免疫功能低下，抗病毒感染能力嚴重下降，與之對應的是腦損傷程度已很嚴重。因此，綜合考慮，血清S100B和NSE水平與T淋巴細胞亞群變化組合對于重癥HFMD的早期辨識有可能成為一條有效的思路。參考文獻[1]Wang YF，Zheng R，Chen BG.Casecontrol study on immuneparameters and clinical significance of handfootmouth disease[J].Zhejiang Prev Med，2010，22（10）：1521.

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（收稿日期：2016-07-25修回日期：2016-10-25）