高效液相色譜法測定蒙藥阿那日八味散中胡椒堿的含量

張 麗

(內蒙古自治區人民醫院，內蒙古 呼和浩特 010020)

阿那日八味散，蒙藥名阿那日巴達瑪，由石榴、益智、肉桂、茇蓽、黑冰片、木鱉子(制)、訶子、玫瑰花8味藥材組成，具有袪“巴干達協日”，散瘀，消食，止痛之功效。蒙醫臨床用于胃潰瘍，消化不良，胃寒疼痛，胃脘脹滿，胃酸嘔吐，腹脹浮腫[1]。該藥收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》蒙藥分冊，原標準中沒有收載相關定性定量指標，為全面控制阿那日八味散的質量，提高該藥的質量標準，故參考文獻[2-6]采用高效液相色譜法對其中蓽茇藥材所含的有效成份胡椒堿進行含量測定，可為該制劑質量標準的提高提供證據。

1 儀器與試藥

大連依利特P230型高效液相色譜儀；UV230+紫外可見檢測器；手動進樣器；KQ5200E型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司，200W，40KHz)。電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司，0.1mg；0.01mg)。

胡椒堿對照品(批號：111637-201206)，購自中國食品藥品檢定研究院；阿那日八味散(呼和浩特中蒙醫院，批號：150112；150213,150312)，甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 含量測定

2.1 色譜條件：Agilent XDB-C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；流動相：甲醇-水(80：20)；流速：1.0mL·min-1；柱溫：室溫；檢測波長：343nm；進樣量：20μL。理論塔板數按胡椒堿計算不得少于2000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備：精密稱取胡椒堿對照品12.04，置200mL棕色容量瓶中，加入無水乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，制成60.20μg·mL-1的溶液，作為對照品儲備液。取對照品儲備液25mL于50mL棕色容量瓶中，加入無水乙醇稀釋至刻度，制成30.10μg·mL-1的溶液，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備：取阿那日八味散約0.18g，精密稱定，置具塞錐形瓶中,加入無水乙醇50mL，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再次稱定重量，加無水乙醇補足減失的重量，搖勻，棄去初濾液，取續濾液即得。

2.2.3 陰性樣品品溶液的制備：按阿那日八味散處方比例稱取除蓽茇外的其余藥材制備陰性樣品，按照制備供試品溶液的方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗：分別吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液各20μL，按“2.1”色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示胡椒堿與其他組分色譜峰可基線分離，分離度符合規定，且陰性樣無干擾。色譜圖見圖1。

2.3.2 線性范圍考察：精密吸取胡椒堿對照品溶液(60.20μg·mL-1)1.5、3.0、5.0、6.5、8.0、10.0mL，分別置于10mL棕色容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別配制成9.030、18.06、30.10、39.13、48.16、60.20μg·mL-1的溶液。按照“2.1”色譜條件，分別測定，以濃度C(μg·mL-1)為橫坐標，峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：Y=207.06X-392.70，r=0.9997。結果顯示，胡椒堿在9.030μg·mL-1-60.20μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度試驗：分別精密吸取供試品溶液(批號：150112)與對照品溶液(30.10μg·mL-1)各20μL，注入高效液相色譜儀，連續進樣6次，結果對照品溶液的RSD=1.7%；供試品溶液的RSD=0.3%。結果表明：該儀器精密度良好，符合含量測定要求。

2.3.4 穩定性試驗：取供試品溶液(批號：150112)，分別于0，2，4，6，8及10小時進樣，測定，記錄峰面積值，RSD=0.9%。結果表明：供試品溶液在10小時內穩定性良好，符合含量測定要求。

2.3.5 重復性試驗：取供試品(批號：150112)約0.18g，精密稱定，共6份，分別按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別吸取20μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，并計算含量，結果胡椒堿的平均含量為3.052mg·g-1，RSD=1.6%。結果表明：該測定方法的重復性較好，符合含量測定要求。

2.3.6 回收率試驗：取已知含量供試品(批號：150112)粉末約0.09g，共6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，每份精密加入胡椒堿對照品溶液(60.20μg·mL-1)4.5mL。水浴蒸干溶劑，分別按供試品溶液的制備方法制備溶液，分別精密吸取20μL，注入高效液相色譜儀，測定含量，計算回收率。平均加樣回收率為98.75%，RSD=1.3%。結果表明：該測定方法的準確度良好，符合含量測定要求，測定結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

2.3.7 耐用性試驗：取供試品(批號：150112)2份,每份約0.18g，精密稱定，分別按“2.2”方法項下制備供試品溶液，另對照品溶液(30.10μg·mL-1)，在不同色譜柱類型(依利特C18、安捷倫C18、迪馬C18)，分別測定供試品含量，RSD為1.5%(n=6)。結果表明：該方法的耐用性良好，符合含量測定要求。

3 樣品的測定

分別取3個不同批號的阿那日八味散供試品約0.18g，精密稱定，分別按供試品溶液的制備方法制備溶液，精密吸取溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算胡椒堿的含量，按照《中國藥典》2015版一部中規定：蓽茇中胡椒堿的含量不得少于2.5%來計算，阿那日八味散含胡椒堿應不低于2.778mg·g-1，測定結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

4 討論

4.1 提取時間的選擇：實驗對超聲提取的時間進行了考察，比較了20min，30min，40min結果，實驗結果顯示，超聲30min和超聲40min含量差別不大，但明顯大于20min，故確定超聲提取時間為30min。

3.2 流動相的選擇：實驗比較了不同的流動相：甲醇—水(77∶23)、甲醇—水(80∶20)。結果表明：用甲醇-水(80∶20)為流動相保留時間適宜，分離效果好，故采用甲醇-水(80∶20)為流動相。

[1]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準.蒙藥分冊[S].1998:117.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.中國醫藥科技出版社, 2015:219.

[3]畢曉黎,孫冬梅,羅文匯,等.HPLC法同時測定復方姜黃微囊中姜黃素和胡椒堿的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2010,16(2)：20-22.

[4]李普全,白音夫.高效液相色譜法測定不同色澤蓽茇中胡椒堿含量[J].中國民族醫藥雜志，2009,(5)：44-45.

[5]包勒朝魯,烏蘭圖雅,那生桑,等.蒙成藥哈日嘎布日-10味片中胡椒堿含量測定[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(1)；81-83.

[6]史文燕,郭寶鳳,王玉華.高效液相色譜法測定四味光明鹽湯散中胡椒堿的含量[J].內蒙古醫科大學學報.2014,36(6)：505-508.