幽門螺桿菌相關性胃腺癌中IL-37的表達及意義

龔謀春，方曉明，姚 寧，劉慧慧，陳琪楓，劉桂寶

·論 著·

幽門螺桿菌相關性胃腺癌中IL-37的表達及意義

龔謀春，方曉明，姚 寧，劉慧慧，陳琪楓，劉桂寶

目的 探討白細胞介素37(IL-37)在幽門螺桿菌(HP)相關性胃腺癌[HP(+)胃腺癌]中的表達及意義。方法 選取2014年1月至2015年12月解放軍第117醫院收治胃腺癌78例(HP+ 46例、HP- 32例)，同期門診HP(+)胃潰瘍及HP(-)正常患者各30例。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)定量檢測各組血漿IL-37蛋白表達；Western blot檢測HP(+)和HP(-)胃腺癌組癌組織內IL-37蛋白表達。逆轉錄(RT)-PCR檢測HP(+)與HP(-)胃腺癌癌組織IL-37 mRNA表達。結果 ①各組血漿IL-37蛋白表達情況：HP(-)正常組與HP(-)胃腺癌組相比，差異無統計學意義(P>0.01)；HP(+)潰瘍組高于HP(-)正常組和HP(-)胃腺癌組，差異均有統計學意義(P<0.01)；HP(+)胃腺癌組高于HP(+)潰瘍組、HP(-)正常組及HP(-)胃腺癌組，差異均有統計學意義(P<0.01)。②胃腺癌組癌組織內IL-37蛋白表達情況：HP(+)組高于HP(-)組，差異有統計學意義。③胃腺癌組癌組織內IL-37 mRNA表達情況：HP(+)組高于HP(-)組，差異有統計學意義(P<0.01)。結論 HP感染后血漿IL-37升高，HP(+)胃癌組織內IL-37蛋白及mRNA表達均升高；IL-37表達升高與HP(+)胃腺癌的發生密切相關。

幽門螺桿菌；胃腺癌；白細胞介素37

幽門螺桿菌(HP)感染是人類最高發的慢性細菌感染之一，全世界范圍內，約有半數人口感染HP。HP感染與胃腺癌關系密切，在1994年WHO就把HP列為胃腺癌I類致癌危險因素，感染者發病率較非感染者高3～6倍[1-2]。白細胞介素37(IL-37)在炎癥性疾病和自身免疫性疾病中呈高表達，研究表明，IL-37具有強大抗炎能力，能夠調節多種細胞因子表達和機體免疫功能[3-5]。胃腺癌是一個與慢性炎癥密切相關的惡性腫瘤，我們檢測了IL-37在這類胃腺癌血漿、癌組織及癌旁組織的表達情況，探討IL-37與HP相關性胃腺癌發病的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2014年1月至2015年12月在我科住院，有我院胃鏡檢查、14C呼氣試驗結果及手術標本的胃腺癌78例[HP(+) 46例、HP(-) 32例]，同期門診HP(+)胃潰瘍及HP(-)正常患者各30例，平均年齡為(61.8±6.0)歲。排除標準：妊娠，有影響全身的心血管、腎、肝等基礎疾病，有合并其他腫瘤，有其他自身免疫性疾病，6個月內有手術、外傷史，6個月內合并急慢性感染及有藥物使用史的患者。本研究方案經過我院倫理委員會批準，研究對象知情同意并簽署知情同意書。14C呼氣試驗及胃鏡結果由我院消化科內鏡中心完成，胃腺癌診斷由我院病理科完成。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理 取入選病例清晨空腹8 h以上靜脈血3 mL，3000 r/min離心10 min，收集上清，于-80 ℃冰箱保存待檢。采用雙抗體夾心ELISA法檢測血漿IL-37水平，操作過程嚴格按照產品說明進行。IL-37 ELISA試劑盒購自瑞士Adipogen 公司，最低檢測濃度為10 pg/mL；胃癌組織切除離體后5 min內取腫瘤中央無壞死及出血部位組織，癌旁組織距腫瘤5 cm左右，組織大小均約1 cm×0.5 cm×0.5 cm，經磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，立即置于液氮罐中保存，用于IL-37 mRNA水平和蛋白檢測。切除、清掃大體標本送病理科檢查。

1.2.2 Western blot檢測組織IL-37蛋白的表達水平 組織標本經過蛋白樣品制備、蛋白定量、蛋白電泳、轉膜、抗體雜交、發光檢測后，結果以灰度值表示。檢測所用的IL-37一抗為兔抗人單抗隆抗體IgG購于美國Abcam公司。

1.2.3 逆轉錄PCR 技術檢測組織IL-37 mRNA的表達水平 取備用的組織，組織經過蛋白裂解液裂解、勻漿，TRIzol試劑法提取總RNA；最后逆轉錄為cDNA。相關引物委托上海生工完成，IL-37引物序列上游：5′-AGTGCTGCTTAGAAGACCCGG-3′，下游：5′-AGAGTCCAGGACCAGTACTTTGTG A-3′。以β肌動蛋白(β-actin)作為內參照，其引物序列上游: 5′-TGGCACTCCAGCACAATGAA-3′，下游:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。反應體系為20 μL，進行實時PCR反應。反應條件：采用兩步法PCR擴增標準程序，預變性，95 ℃ 30 s；PCR反應，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40 個循環。記錄循環閾值(Ct值)，以相對定量方法計算IL-37 mRNA的表達水平。

Western blot檢測IL-37蛋白表達，用ImageJ2x軟件分析蛋白條帶，IL-37蛋白相對含量以目的蛋白灰度值與內參GAPDH灰度值的比值表示。RT-PCR檢測組織IL-37 mRNA表達，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Band Leader 3.0凝膠圖像分析系統分析，IL-37 mRNA的值用IL-37與β-actin掃描密度值之比表示。

2 結 果

2.1 各組血漿IL-37蛋白表達情況 血漿IL-37蛋白水平由HP(-)正常組、HP(-)胃腺癌組、HP(+)潰瘍組、HP(+)胃癌腺組依次升高。HP(+)潰瘍組高于HP(-)正常組和HP(-)胃腺癌組，HP(+)胃腺癌組高于其他組，差異均有統計學意義(P<0.01)；HP(-)正常組和HP(-)胃腺癌組相比，差異無統計學意義(P>0.01)，見表1。

組別nIL-37HP(-)正常組3019.51±4.61*#HP(-)胃腺癌組3223.64±6.72*#HP(+)潰瘍組3066.11±20.92*HP(+)胃癌腺組4678.97±24.67與HP(+)胃癌腺組比較,*P<0.01;與HP(+)潰瘍組比較,#P<0.01

2.2 胃腺癌組癌旁組織及癌組織IL-37蛋白表達情況 HP(+)和HP(-)胃腺癌組癌旁組織及癌組織均有IL-37蛋白的表達，癌組織IL-37蛋白均高于癌旁組織，見圖1；分析條帶光密度值，計算各組IL-37蛋白與GAPDH光密度的比值，HP(+)胃腺癌組癌組織內IL-37蛋白表達高于HP(-)胃腺癌組癌組織，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

1、3：HP(-)胃腺癌組癌旁組織及癌組織；2、4：HP(+)胃腺癌組癌旁組織及癌組織。GAPDH：內參；IL-37：白細胞介素37

圖1 2組胃腺癌癌旁組織及癌組織內IL-37蛋白電泳圖

組別nIL-37/GAPDHHP(-)胃腺癌組32 癌旁組織0.212±0.046 癌組織0.764±0.063*HP(+)胃癌腺組46 癌旁組織0.372±0.013 癌組織1.330±0.065*#與本組癌旁組織比較,*P<0.01;與HP(-)胃腺癌組癌組織比較,#P<0.01

2.3 胃腺癌癌組織內IL-37mRNA表達 HP(+)胃腺癌組癌組織IL-37 mRNA表達顯著高于HP(-)胃腺癌組，表達水平分別為(0.4787±0.0707)和(0.1817±0.0428)，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

與HP(-)胃腺癌組比較，*P<0.01

圖2 HP(+)與HP(-)胃腺癌癌組織中IL-37mRNA表達

3 討 論

HP感染是人類最高發的慢性細菌感染之一，全世界范圍內，約有半數人口感染HP。HP感染與胃腺癌關系密切，感染者發病率較非感染者高3～6倍。在1994年，WHO就把HP列為胃腺癌I類致癌危險因素。當人體胃部黏膜表皮受到HP感染后容易造成局部區域細胞變性、壞死等，引起胃部組織出現萎縮、分化障礙，導致腸化生，甚至引起異型增生，最終演變為胃腺癌[6]。因此，HP相關性胃腺癌是個與慢性炎癥密切相關性惡性腫瘤，這個過程是一個慢性反復的炎癥過程[7-8]。白細胞介素1(IL-1)家族被認為是調控炎癥反應的重要因子，可能與胃惡性腫瘤相關[9]。IL-37是新近發現的IL-1家族中的一員，在體內及體外均被證實能抑制多種促炎因子的表達，具有強大抗炎能力[10]。已有研究表明，IL-37在非小細胞肺癌中可抑制腫瘤血管生成的作用[11]，我們對IL-37在HP相關性胃癌之間的關系作了初步探討。

我們的研究發現，HP(-)組和HP(-)胃腺癌組血漿IL-37表達無明顯差異，HP(+)潰瘍組血漿IL-37蛋白表達高于HP(-)組和HP(-)胃腺癌組。可以認為HP感染后胃組織存在慢性炎癥，血漿IL-37蛋白表達升高是機體炎癥反應的表現。這與既往研究認為IL-37表達在炎癥性疾病中表達增高相一致。我們還發現，HP(+)胃腺癌癌組織與HP(-)胃腺癌癌組織標本相比，HP(+)胃腺癌組織內IL-37蛋白及mRNA表達均升高，這提示從胃組織HP慢性感染開始至胃組織惡變的全過程中，均存在IL-37表達升高這一改變。我們也檢測了2組胃腺癌組癌組織與癌旁組織內IL-37蛋白表達，發現胃腺癌組織中IL-37蛋白與癌旁組織相比均升高，可能提示胃組織發生惡變后，不管有無幽門螺桿菌感染，均存在有包括免疫細胞的浸潤在內的炎癥性改變。

對IL-37轉基因小鼠體內DC的活性研究發現，IL-37可顯著抑制經LPS刺激后樹突狀細胞(dendritic cell, DC)活性，其機制為顯著狀少DC表面CD86和主要組織相容性復合物Ⅱ(MHCⅡ)的平均表達量(由73%下降為47%)[4]。在HP感染的慢性炎癥過程中，病情有淺表性胃炎-慢性萎縮性胃炎-腸化-異型增生-癌變的變化過程[12]。免疫監視的缺失在組織發生惡變過程中起到至關重要。DC是免疫反應起始環節，在免疫應答中起著關鍵的作用，隨著IL-37水平升高，DC活性的功能減弱，抑制了免疫細胞的趨化及關鍵的某些免疫反應，可能是胃腺癌形成的因素之一。研究表明IL-37主要有兩條作用途徑：①分泌到胞外通過IL-18R發揮作用；②轉運到細胞核內與Smad3等因子相互作用影響多個因子的轉錄[3]。在對胃癌的發病機制研究發現，Smad3基因是一個重要環節，敲除小鼠Smad3后發現，小鼠胃小彎側開始發生腸化生、侵襲性胃癌形成[13]。Smad3 過表達能顯著減少胃腺癌細胞的成瘤性，而表達減少則胃癌的發生率顯著增高[14-15]。因此，我們推測，HP(+)胃腺癌中IL-37升高，可能與Smad3這個胃癌早期形成過程中的關鍵性信號通路相互作用有關。本研究期間中，未獲得HP(-)正常胃組織標本，因此未進行正常胃組織與胃腺癌組織及癌旁組織IL-37蛋白與mRNA表達的比較。兩者關系需進一步獲得標本后驗證。

總之，HP相關性胃腺癌是與慢性炎癥密切相關的惡性腫瘤，IL-37作為重要的抗炎因子在HP的慢性感染過程中表達升高。HP(+)胃腺癌病例血漿IL-37蛋白表達均高于正常病例、HP(+)潰瘍病例及HP(-)胃腺癌病例，HP(+)胃腺癌癌組織內IL-37表達高于HP(-)胃腺癌組織。因此，IL-37表達與HP相關性胃腺癌密切相關，在HP相關性胃腺癌的發生、發展中的作用及機制需進一步研究。

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(本文編輯:葉華珍； 英文編輯：王建東)

IL-37 level in HP positive patients with gastric adenocarcinoma

GONG Mou-chun, FANG Xiao-ming, YAO Ning, LIU Hui-hui, CHEN Qi-feng, LIU Gui-bao

(DepartmentofGeneralSurgery,the117thHospitalofPLA，Hangzhou310004，Zhejiang，China)

Objective To investigate the expression of interleukin-37 in Helicobacter pylori(HP) positive patients with gastric adenocarcinoma. Methods 78 cases of patients with gastric adenocarcinoma recruited in our hospital from January 2014 to December 2015 were selected. Among them, seventy-eight inpatients with gastric adenocarcinoma [HP(+) 46 cases, HP(-) 32 cases], and 30 outpatients with HP(+) gastric ulcer, and 30 outpatients with HP(-) were studied. The plasma IL-37 levels of each group were determined by ELISA. Western blot was used to test IL-37 protein in cancer tissue of HP(+) and HP(-) cases with gastric adenocarcinoma. And RT-PCR was used to test IL-37 mRNA in cancer tissue of HP(+) and HP(-) cases with gastric adenocarcinoma tissue. Results ① Expression of plasma IL-37 protein in each group: there were no statistically significant difference between HP(-) group and HP(-) cases with gastric adenocarcinoma (P>0.01). It was increased signifcantly in the HP(+) ulcer group compared with HP(-) group and HP(-) cases with gastric adenocarcinoma (P<0.01), and it was increased signifcantly in HP(+) cases with gastric adenocarcinoma compared with other groups (P<0.01). ② Expression of IL-37 protien in gastric adenocarcinoma tissue: it was increased signifcantly in HP(+) cases with gastric adenocarcinoma compared with HP(-) cases with gastric adenocarcinoma (P<0.01). ③ Expression of IL-37 mRNA level in gastric adenocarcinoma tissue: it was increased signifcantly in HP(+) cases with gastric adenocarcinoma compared with HP(-) cases with gastric adenocarcinoma (P<0.01). Conclusion The plasma IL-37 level was increased when patients were infected by HP, and the expression of IL-37 protein and mRNA were increased significantly in gastric adenocarcinoma tissue of HP (+) patient with gastric adenocarcinoma. IL-37 might involved in the occurrence and development of gastric adenocarcinoma in patients with HP.

Helicobacter pylori; Gastric adenocarcinoma; Interleukin-37

310004杭州，解放軍第117醫院普外科

方曉明，E-mail：FXM117@163.com

龔謀春，方曉明，姚 寧,等.幽門螺桿菌相關性胃腺癌中IL-37的表達及意義[J].東南國防醫藥，2017,19(2):153-156.

R735.2

A

1672-271X(2017)02-0153-04

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.02.010

2016-08-28;

2017-02-18)