1,25(OH)2D3減輕小鼠局灶性腦缺血再灌注后炎性反應

石艷超， 陳秀菊， 郭 英

1,25(OH)2D3減輕小鼠局灶性腦缺血再灌注后炎性反應

石艷超1， 陳秀菊2， 郭 英3

目的 探討1,25(OH)2D3對小鼠局灶性腦缺血再灌注后炎性反應的作用及其機制。方法 造模前，通過一個月低維生素D飲食喂養，小鼠隨機分為假手術組、局部缺血再灌注組(模型組)和1,25(OH)2D3組(治療組)。造模前3 d始，假手術組和模型組每天腹腔注射2.4%乙醇，治療組腹腔注射1,25(OH)2D3，共持續6 d。再灌注72 h后，Zea Longa法對鼠進行神經功能評分，干濕重法測量缺血側腦組織含水量，RT-PCR法檢測缺血側半球IL-1β mRNA和TNF-α mRNA表達，采用Western blot法檢測缺血側半球NF-κB p65和Claudin-5的表達。結果 與模型組比較，缺血再灌注后72 h，治療組小鼠神經功能評分較低，缺血側半球腦含水量、IL-1β mRNA、TNF-α mRNA和NF-κB p65表達顯著減少，Claudin-5表達顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 1,25(OH)2D3減輕小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后炎性反應，其機制通過抑制NF-κB的活化有關。

1,25(OH)2D3； 腦缺血再灌注； NF-κB； 炎性反應

炎性反應是腦缺血再灌注 (cerebral ischemia reperfusion injury,CIR) 損傷中復雜的級聯反應之一，涉及多種炎性介質、炎性細胞及炎癥反應通路，阻斷CIR中炎性反應可顯著減輕腦損傷。1,25(OH)2D3是維生素D在體內的活性形式，其對哺乳類動物T細胞的表達有影響。有研究表明[1]，在周圍和中樞神經系統中，1,25(OH)2D3抑制了炎性反應，對疾病有治療作用，但其在CIR中的作用尚未明確。本實驗通過構造動物模型，觀察1,25(OH)2D3對小鼠腦缺血后，神經功能缺損和腦水腫的程度，Claudin-5表達的情況，IL-1β、TNF-α及NF-κB p65等炎性標志物的變化，旨在探討1,25(OH)2D3對CIR中炎性反應的影響，以期為臨床治療腦梗死提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理 健康6周齡雄性C57BL/6J小鼠，體重14～18 g，清潔級。低維生素D飲食喂養一個月后，隨機分為假手術組、模型組和治療組。造模前3 d始，假手術組和模型組腹腔注射同體積的溶于生理鹽水的 2.4% (v/v) 乙醇，治療組腹腔注射1,25(OH)2D3(50 ng/d，Sigma-Aldrich)，共持續6 d。

1.2 小鼠CIR模型制作 參照文獻[2]報道的Zea Longa法制備改良線栓法大腦中動脈栓塞模型。術前禁食12 h，不禁飲。腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉，仰臥位固定于37 ℃恒溫電熱板上。取頸部正中切口，游離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，結扎頸總動脈近心端，以無創血管夾夾閉頸總動脈遠心端及頸外動脈，于頸總動脈分叉下方剪開一切口，放置預先頭端鈍化處理的尼龍線(北京沙東生物)，緩慢推進8～10 mm，感覺有阻力時停止，固定于頸總動脈。栓塞1 h后，拔出線栓恢復血流。單籠飼養，自由飲食。再灌注后2 h采用神經功能評分驗證造模是否成功，即造模小鼠出現右側Horner征和左側以上肢為重的偏癱，作為動物模型成功的判定標準，剔除不符合標準或死亡的動物，并隨機補充。假手術組除不插入線栓外其余相同。

1.3 小鼠神經功能評定 于再灌注后72 h時，進行神經功能評分，參照Zea Longa評分標準：0分,無神經損傷癥狀；1分,輕微神經功能缺損，不能完全伸展對側前爪；2分,重度局灶性神經功能缺損，向對側轉圈；3分,重度局灶性神經功能缺損，向對側傾倒；4分,不能自發行走，意識喪失。

1.4 腦梗死體積的測定 取再灌注后72 h的小鼠，斷頭取腦置入-20 ℃冰箱內，30 min后取出，自視交叉水平行5個腦冠狀切片，片厚約2 mm，將其置于2%的TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min，染色后置于10%甲醛溶液中于4 ℃避光固定24 h，肉眼觀察并拍照。應用Image J 1.46 軟件計算腦梗死體積，公式為：腦梗死體積(%)=[總的梗死體積-(右側半球體積-左側半球體積)]/左側半球體積×100%。

1.5 腦組織含水量的測定 再灌注后72 h，經神經功能評分后，立即將小鼠斷頭處死。取缺血側腦組織迅速稱其濕重，然后置于100 ℃高溫烤箱內，烘干48 h后稱其干重。按照Elliott公式，計算出腦含水量，公式為：腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6 Western blot法檢測缺血側腦組織NF-κB p65和Claudin-5的表達 取再灌注后72 h的小鼠，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉后，冰PBS心臟灌流，斷頭取腦。取缺血側大腦半球，提取腦組織蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)檢測蛋白濃度。每孔加入等量蛋白，10%SDS-PAGE凝膠進行電泳，然后轉移至甲醇浸泡過的PVDF膜上，1.5%胎牛血清室溫封閉1 h后，分別加入NF-κB p65一抗(1∶1000,CST)、Claudin-5一抗(1∶1000,Introgen)和β-actin一抗(1∶2000,Santa Cruz)，室溫孵育12 h后，置入4 ℃冰箱過夜。加入二抗(1∶5000,Transgen Biotech)，室溫孵育2 h。每個條帶加入顯影液發光，采用Image J軟件測定灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

1.7 實時定量PCR 取每只小鼠缺血側大腦半球，獲得總 RNA后取10 μl按照反轉錄酶Ⅱ試劑盒行逆轉錄操作，引物序列分別為：IL-1β：上游：5’-GTGGAACTTGAGGCCACATT-3’,下游：5’-TGTGACAAAAATGCCTGGAA-3’；TNF-α：上游：5’-CCAAGCCTTATCGGAAATGA-3’，下游：5’-TCTCACCCAGGGAATTACAAA-3’；內參β-actin 上游 5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’，下游5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG- 3’。擴增條件為：95 ℃預變性30 s，進入循環，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共循環40次，隨后95 ℃延伸15 s，60 ℃延伸1 min，95 ℃再延伸15 s，最后降至4 ℃。分別得到IL-1β、TNF-α和內參β-actin的Ct值后，采用相對定量的方法計算，△Ct=目的基因Ct值-內參基因Ct值。以2-△Ct為指標，分別計算出IL-1β、TNF-α和內參β-actin mRNA的相對表達水平。實驗重復3次，求得平均值作為分析結果。

2 結 果

2.1 神經功能評分 小鼠取材前進行神經功能評分。假手術組因未閉塞大腦中動脈，未出現神經功能缺損癥狀，評分均為0分。與假手術組比較，模型組和治療組的神經功能評分升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組神經功能評分降低(P<0.05)(見表1)。

2.2 腦梗死體積和含水量的測定 假手術組小鼠腦組織未見腦梗死區域，模型組可見明顯腦梗死灶(P<0.01)，與模型組相比，治療組中梗死灶體積明顯減小(P<0.05)；3組間腦含水量有明顯差異(P<0.05)，治療組腦含水量較模型組低(P<0.05)(見表2)。

2.3 NF-κB p65和Claudin-5蛋白的表達量 與假手術組比較，模型組和治療組的NK-κB p65表達明顯上調(P<0.05)；與模型組比較，治療組的NF-κB p65的表達減少(P<0.05)。與假手術組比較，模型組和治療組的Claudin-5表達明顯減少(P<0.05);與模型組比較，治療組Claudin-5的表達增加(P<0.05)(見圖1、表3)。

2.4 IL-1β和TNF-α表達量 與假手術組比較，模型組和治療組的IL-1β和TNF-αmRNA相對表達量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組的IL-1β和TNF-αmRNA相對表達量明顯降低(P<0.05)(見表4)。

表1 腦再灌注后72 h各組小鼠神經功能評分±s)

與假手術組相比較*P<0.05；與模型組相比較#P<0.05

表2 腦再灌注后72 h各組小鼠腦梗死體積及 腦含水量比較±s)

與假手術組相比較*P<0.05；與模型組相比較#P<0.05

表3 腦再灌注后72 h各組小鼠腦組織NF-κB p65和 Claudin-5的表達量

與假手術組相比較*P<0.05；與模型組相比較#P<0.05

表4 腦再灌注后72 h各組小鼠腦組織IL-1β mRNA和 TNF-α mRNA 相對表達量

與假手術組相比較*P<0.05；與模型組相比較#P<0.05

圖1 再灌注后72 h，各組小鼠梗死側腦組織NF-κB p65 和Claudin-5印跡條帶

3 討 論

CIR損傷的機制主要包括興奮性氨基酸毒性、細胞內鈣超載、一氧化碳失調控、炎性反應等。炎性反應在CIR損傷中起著關鍵作用，加重了腦損害[3～5]，其病理基礎以IL-1β和TNF-α等為代表的多種炎性介質失控、釋放而形成“瀑布效應”，引起繼發性神經細胞變性、壞死、凋亡等[6,7]。IL-1β是觸發炎性反應的重要介質之一，腦缺血后其表達增多，對神經元有毒性作用，目前認為其是急性缺血期腦損傷程度的一個標志[8,9]。TNF-α是中樞神經系統參與炎性反應和免疫應答的重要介質，其可激活小膠質細胞、破壞BBB、促進炎性細胞的遷移，最終對神經元造成損傷[4,10～12]。

1,25(OH)2D3是維生素D在體內的活性形式，其除有維持體內鈣磷平衡的作用，還有免疫調節作用，在很多疾病中參與免疫反應，下調炎性細胞及致炎性細胞因子的生成，對疾病起到了治療作用[13]。基于以上研究，我們推測，1,25(OH)2D3通過影響免疫系統對腦梗死可能起到治療作用。

CIR模型是研究腦梗死較好的動物模型，腦梗死的體積直接反映了腦損傷的嚴重程度，神經功能評分間接反映了病情的嚴重程度。本實驗連續6 d對實驗動物注射1,25(OH)2D3，為了避免食物因素對體內1,25(OH)2D3的影響，參照Joshi S等人研究[14]，在造模前一個月，對實驗動物實施了低維生素D飼料喂養。本實驗發現，治療組的神經功能評分及腦含水量低于模型組，提示1,25(OH)2D3能夠在一定程度上改善腦梗死小鼠的神經功能減輕腦水腫程度。我們的實驗還發現，腦缺血再灌注后，IL-1β和TNF-α炎性因子于梗死側半球異常過度表達，加重了腦水腫的程度。在多種細胞中，缺血、缺氧誘發了NF-κB的活化[15,16]，活化的NF-κB誘導了細胞凋亡，加重了病情。治療組中，NF-κB p65的表達明顯減少，神經功能評分減低，我們推測1,25(OH)2D3在一定程度上抑制了NF-κB的活化。

Claudin-5與BBB通透性的調節密切相關，其表達變化可作為衡量BBB損傷程度的標志，腦損傷后其表達明顯下降，提示BBB透性增加[15,17,18]。為了解1,25(OH)2D3在腦缺血再灌注后對血腦屏障的影響，我們觀察了代表BBB功能的Claudin-5的表達水平。實驗中發現，與模型組相比較，治療組中Claudin-5的表達水平降低及腦水腫程度降低，由此，我們推測1,25(OH)2D3具有保護BBB功能，或許能夠為腦梗死治療提供一種方法。

總之，我們的研究發現，1,25(OH)2D3保護了BBB，在一定程度上，抑制了致炎性細胞因子的產生，減少了Claudin-5蛋白的降解，發揮了對BBB的保護作用，減輕了腦水腫和腦梗死體積，促進神經功能的恢復，其機制可能是通過抑制NF-κB的激活，對CIR損傷腦組織起到了一定的保護作用。另外，患者腦梗死后，部分由于進食障礙，造成維生素D攝入減少，可能會加重腦梗死病情。提示我們在臨床工作中，重視維生素D在腦梗死患者中的作用。

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1,25(OH)2D3ameliorates inflammatory response after focal cerebral ischemia reperfusion in mice

SHIYanchao,CHENXiuju,GUOYing.

(DepartmentofNeurology,PorthospitalofTianjin,Tianjin300456,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of 1,25(OH)2D3on inflammatory response after focal cerebral ischemia reperfusion in mice.Methods After one month of low vitamin D diet,mice were randomly divided into sham-operated group,vehicle group and 1,25(OH)2D3treatment group.3 days before and after the induction of focal cerebral ischemia reperfusion,through intraperitoneal injection,sham-operated group and vehicle group mice were given 2.4% ethanol every day,and 1,25(OH)2D3treatment group mice were given 1,25(OH)2D3.72 h after ischemia reperfusion,neurological function deficits were assessed by Zea Longa method,brain water content was examined by wet and dry weight method,the expression of IL-1β mRNA and TNF-α mRNA in ischemic hemisphere was assessed by RT-PCR method,and Western blot method was used to detect the expression of NF-κB p65 and Claudin-5.Results 72 h after ischemia reperfusion,in 1,25(OH)2D3group,neurological function deficits score,brain water content,the expression of IL-1β mRNA,TNF-α mRNA and NF-κB p65 in ischemic hemisphere were significantly lower or smaller than those in the vehicle group (P<0.05),and the expression of Claudin-5 was significantly higher (P<0.05).Conclusion 1,25(OH)2D3ameliorates inflammatory response of focal cerebral ischemia reperfusion in mice and the mechanism may through inhibits the activation of NF-κB.

1,25(OH)2D3； Cerebral ischemic reperfusion； NK-κB； Inflammatory response

1003-2754(2017)04-0304-04

2016-12-20；

2017-03-30

(1.天津港口醫院神經內科，天津 300456；2.天津南開醫院神經內科，天津 300381；3.天津醫科大學總醫院耳鼻喉科，天津 300052)

陳秀菊，E-mail:91sqs@sina.com

R743.3

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