BMSCs聯(lián)合硫酸軟骨素酶ABC移植修復大鼠脊髓損傷的研究

余云湖+付曉紅+楊開華+文遠超+王飛

【摘要】 目的：探究BMSCs聯(lián)合硫酸軟骨素酶ABC（ChABC）移植修復大鼠脊髓損傷的研究。方法：選取新生SD大鼠股骨、脛骨骨髓分離培養(yǎng)鑒定出MSCs，對貼壁培養(yǎng)的BMSCs進行神經(jīng)誘導培養(yǎng)。取成年雄性SD大鼠32只，體重200～260 g，利用大鼠T10脊髓半橫斷模型進行半橫斷，脊髓損傷模型制備完成后，隨機分為對照組（A組）、BMSCs組（B組）、硫酸軟骨霉素ABC注射組（C組）和硫酸軟骨霉素ABC聯(lián)合BMSCs移植組（D組），每組8只。傷后1～2周采用BBB評分法評價大鼠后肢運動功能，傷后2周取材行HE染色計算損傷區(qū)面積，采用免疫熒光染色法觀察BMSCs分化為功能性神經(jīng)細胞的情況。結(jié)果：統(tǒng)計分析1～2周后四組大鼠的BBB評分情況，D組大鼠明顯高于其余三組，且差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但A組、B組、C組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；對比2周后四組大鼠的損傷區(qū)面積，D組大鼠損傷區(qū)面積明顯小于A組，且差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），A組、B組、

C組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；通過熒光染色后對CSPG區(qū)域熒光強度的觀察，四組大鼠比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），GFAP/GAP方面D組明顯大于A、B、C三組，四組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：采用BMSCs聯(lián)合硫酸軟骨霉素ABC可促進神經(jīng)纖維再生，對大鼠脊髓損傷修復有一定促進作用。

【關(guān)鍵詞】 BMSCs； 硫酸軟骨霉素酶ABC； 移植修復； 脊髓損傷

Research on BMSCs Combined with Chondroitinase ABC Transplantation for Spinal Cord Injury in Rats/YU Yun-hu，F(xiàn)U Xiao-hong，YANG Kai-hua，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（11）：031-033

【Abstract】 Objective：To explore the effect of BMSCs combined with chondroitinase ABC（ChABC） transplantation for spinal cord injury in rats.Method：MSCs was isolated and cultured from bone marrow of femur and tibia of neonatal SD rats.The culture of BMSCs was carried out by adherent culture.Rat models of spinal cord injury were prepared.The model rats were randomly divided into the control group（group A），BMSCs group（group B），chondroitin sulfate amphotericin ABC injection group（group C） and chondroitin sulfate amphotericin ABC combined with BMSCs transplantation group（group D）.The number of each group was 8 rats.BBB score was used to evaluate hindlimb motor function after 1-2 weeks，HE staining was used to calculate the damage area after 2 weeks，immunofluorescence staining was used to observe the differentiation of BMSCs into functional neurons.Result：BBB scores of four groups of rats after 1-2 weeks were statistically analyzed.BBB scores of group D were significantly higher than those of the other three groups，and the differences were statistically significant（P<0.05），and there were not significant differences among group A，B，C.The injury area of group D were significantly less than that of group A（P<0.05），and there were no not significant differences among group A，B，C.The fluorescence intensity of CSPG was observed by fluorescence staining，there were significantly between the four group（P<0.05）.GFAP/GAP of group D was significantly higher than those of the other three groups（P<0.05）.Conclusion：The combination of BMSCs and chondroitin sulfate ABC can promote the regeneration of nerve fibers and promote the repair of spinal cord injury in rats.

【Key words】 BMSCs； Chondroitinase ABC； Transplantation repair； Spinal cord injury

First-authors address：The First Peoples Hospital of Zunyi City，Zunyi 563002，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.11.009

脊髓損傷的修復一直是臨床的一道難題，脊髓損傷形成的機械性障礙以及其內(nèi)部化學成分所導致的化學屏障共同阻礙了中樞神經(jīng)軸突的生長[1-2]。BMSCs取材簡便、排異反應不明顯，具有多項分化的潛能，是脊髓損傷細胞治療較為理想的種子細胞[3]。硫酸軟骨素酶ABC可特異性降解CSPG，且不破壞其他組織結(jié)構(gòu)，可對BMSCs細胞的分化提供一定的保障[4]。故本實驗采用BMSCs聯(lián)合硫酸軟骨霉素移植修復脊髓損傷，觀察其對半橫斷脊髓損傷的修復作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 取成年雄性SD大鼠32只，體重200～260 g，利用大鼠T10脊髓半橫斷模型進行半橫斷，脊髓損傷模型制備完成后，隨機分為對照組（A組）、BMSCs組（B組）、硫酸軟骨霉素ABC注射組（C組）和硫酸軟骨霉素ABC聯(lián)合BMSCs移植組（D組），每組8只。傷后采用評分法評價大鼠后肢運動功能，取材進行行染色計算損傷區(qū)面積。

1.2 方法 脊髓版橫斷模型制備完成后，對照組（A進組）不行修復處理；BMSCs組（B組）僅使用BMSCs對大鼠脊髓進行修復處理；硫酸軟骨霉素ABC注射組（C組）僅使用硫酸軟骨霉素ABC進行修復處理；硫酸軟骨霉素ABC聯(lián)合BMSCs移植組（D組）使用硫酸軟骨霉素ABC聯(lián)合BMSCs進行修復處理。

1.3 觀察指標

1.3.1 運動功能 半橫斷模型制備后觀察各組大鼠后肢運動功能情況，并于1～2周后采用BBB評分法對四組大鼠進行運動功能評定。

1.3.2 組織學觀察 進行版半橫斷模型制備后6周過量麻醉處死全部大鼠，以400 mL 4%多聚甲醛灌注后，將以脊髓損傷區(qū)為中心的2 cm脊髓全部取出，進行連續(xù)矢狀切片，片厚20 μm。挑選部分切片進行常規(guī)HE染色，染色完成后對四組大鼠的脊髓損傷面積及空洞大小進行觀察。

1.3.3 免疫熒光觀察 采用免疫熒光染色法對脊髓損傷區(qū)進行染色，觀察膠質(zhì)纖維酸性蛋白（硫酸軟骨素蛋白多糖）和生長相關(guān)蛋白，雙標表達情況。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用F檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠運動功能評估 對比四組大鼠進行脊髓半橫斷后1～2周的后肢運動功能情況，A、B、C三組大鼠的后肢功能運動情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），D組BBB評分高于其他三組，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05），見表1。

2.2 四組大鼠損傷區(qū)面積比較 傷后1～2周，各組大鼠損傷區(qū)皆有空洞形成，且A、B、C三組間對比差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），D組損傷區(qū)面積明顯小于A、B、C三組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 四組大鼠免疫熒光強度值比較 CSPG熒光強度方面A組明顯大于B、C、D三組，GFAP/GAP方面D組明顯大于A、B、C三組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

3 討論

脊髓損傷因受傷位置特殊，其自身的再生修復能力較差，且傷區(qū)的化學以及機械性因素導致脊髓損傷病理過程無法選擇且不能控制[5-8]。因此有化學性因素導致的繼發(fā)性脊髓損傷嚴重影響且決定著預后情況，此過程可施加治療予以緩解，甚至阻止病程進一步惡化。作為一種較為理想的細胞來源，國內(nèi)外均有報道BMSCs可在損傷區(qū)存活并分化，可移植修復脊髓損傷的實驗[9-11]。因此了解脊髓損傷后CSPG的分布變化有助于確定理想的治療方案，可以更好地輔助BMSCs細胞的分化[12-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，T10脊髓半橫斷模型可較好地模擬脊髓損傷的病理過程，本實驗選取大鼠脊髓半橫斷作為脊髓損傷模型，傷后5 d進行BMSCs細胞移植和硫酸軟骨霉素ABC注射，對脊髓損傷后自我形成的化學屏障進行干預。有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓全橫斷損傷后，其膠質(zhì)細胞在損傷區(qū)周圍組織內(nèi)增生且形成膠質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但并未對神經(jīng)纖維的再生產(chǎn)生完全的機械性阻礙[15-16]。因此機械性損傷并不能阻礙神經(jīng)細胞的再生，其主要阻礙來自化學屏障方面[17]。在正常脊髓中CSPG的含量較少，因脊髓損傷導致膠質(zhì)細胞大量增生，其分泌的CSPG增多，重新分化的神經(jīng)軸突的生長會規(guī)避CSPG區(qū)域，形成對脊髓神經(jīng)生長的抑制和誘導[18-20]。本研究通過使用硫酸軟骨霉素ABC早期抑制CSPG的產(chǎn)生，降低對神經(jīng)細胞再生的抑制，從而達到改變神經(jīng)細胞生長環(huán)境以及控制神經(jīng)細胞再生方向的目的，誘導BMSCs細胞進行分化。通過對四組大鼠損傷區(qū)域的比較，2周后D組損傷區(qū)面積明顯小于對照組的損傷區(qū)面積，四組大鼠BBB評分方面，D組大鼠評分高于其他三組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。通過熒光染色可觀察到硫酸軟骨霉素ABC、BMSCs注射后免疫強度降低，脊髓損傷后神經(jīng)結(jié)構(gòu)的修復得到了加強，表明兩者聯(lián)合使用對脊髓損傷的修復有促進作用[21-23]。

脊髓損傷內(nèi)神經(jīng)細胞軸突能否再生取決于其抑制與促進間的動態(tài)平衡關(guān)系。本研究通過使用BMSCs聯(lián)合硫酸軟骨霉素ABC修復脊髓損傷，影響了促進與抑制兩方面的作用，對脊髓損傷的修復起到了一定程度上的促進作用。

參考文獻

[1]張純，賀西京，李浩鵬.硫酸軟骨素酶ABC聯(lián)合BMSCs修復大鼠脊髓損傷的實驗研究[J].中國修復重建外科雜志，2013，27（5）：541-546.

[2]李敬花，張濤，張紅軍，等.硫酸軟骨素酶ABC聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植對脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復作用[J].第三軍醫(yī)大學學報，2015，37（2）：122-127.

[3]唐亮，靳興，郭振海，等.脊髓損（戰(zhàn)）傷及其神經(jīng)干細胞療法[J].實用醫(yī)藥雜志，2015，32（4）：299-301.

[4]廖燁暉，鐘德君，康敏，等.全反式維甲酸干預鼠胚神經(jīng)干細胞聯(lián)合膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及硫酸軟骨素酶ABC移植修復大鼠脊髓損傷的研究[J].中國修復重建外科雜志，2015，29（8）：1009-1015.

[5]李兵奎，曾彬，常巍，等.骨髓間充質(zhì)干細胞靜脈移植對脊髓損傷大鼠生長相關(guān)蛋白-43表達的影響[J].中國康復理論與實踐，2015，21（12）：1391-1396.

[6]余永濤，廖燁暉，唐強，等.硫酸軟骨素酶ABC及Nogo-66受體拮抗劑聯(lián)合鼠胚神經(jīng)干細胞移植對大鼠脊髓損傷的影響[J].中國脊柱脊髓雜志，2016，26（6）：527-536.

[7]余云湖，駱旭東，朱濤，等.BMSCs聯(lián)合硫酸軟骨素酶ABC移植修復大鼠脊髓損傷的研究[A].中華醫(yī)學會貴州省神經(jīng)外科分會.2013年貴州省神經(jīng)外科年會論文集[C].中華醫(yī)學會貴州省神經(jīng)外科分會，2013.

[8]尤克民.絲素蛋白多孔支架聯(lián)合硫酸軟骨素酶ABC治療大鼠脊髓損傷[D].蘇州：蘇州大學，2014.

[9]王晶.經(jīng)肋間動脈移植骨髓基質(zhì)細胞治療脊髓損傷的實驗研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學，2014.

[10]王冠.甲酰基肽受體和Ⅱ型膠原活化NSCs和BMSCs促進脊髓損傷修復的體外研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學，2015.

[11]李敬花.硫酸軟骨素酶ABC聯(lián)合骨髄間充質(zhì)干細胞移植對脊髄損傷后神經(jīng)功能恢復的作用[D].重慶：重慶醫(yī)科大學，2015.

[12]張濤.硫酸軟骨素酶ABC對大鼠脊髓損傷后軸突髓鞘化和膠質(zhì)瘢痕的影響[D].蘇州：蘇州大學，2013.

[13]韓齊.皮質(zhì)脊髓聯(lián)系缺失后小鼠脊髓運動神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的可塑性研究[D].廣州：暨南大學，2015.

[14]瞿文瑞.Lenti-ChABC與Schwann cell聯(lián)合干預對大鼠脊髓損傷修復的影響[D].長春：吉林大學，2016.

[15]張雪松.外胚層間充質(zhì)來源的神經(jīng)干細胞-纖維蛋白支架復合體移植修復大鼠脊髓損傷的實驗研究[D].鎮(zhèn)江：江蘇大學，2016.

[16]夏永智.反義波形蛋白cDNA與硫酸軟骨素酶聯(lián)合干預對大鼠脊髓損傷修復的影響[D].重慶：第三軍醫(yī)大學，2009.

[17]曾智謀.BMSCs聯(lián)合促紅細胞生成素治療大鼠脊髓損傷的實驗研究[D].長沙：中南大學，2014.

[18]陳彥釗，周以齊，程祥利，等.面向脊髓損傷早期康復的虛擬現(xiàn)實訓練環(huán)境[J].北京工業(yè)大學學報，2014，40（2）：272-277.

[19]陳勝，金正帥.不同時期局部移植人臍帶間充質(zhì)干細胞修復脊髓損傷的組織學觀察[J].中國組織工程研究，2016，20（45）：6714-6719.

[20]于陽，李玥，張廣浩，等.適用于臨床及動物試驗的高頻重復經(jīng)顱磁刺激系統(tǒng)設(shè)計及其應用[J].高電壓技術(shù)，2013，39（1）：181-187.

[21]李劍鋒，閆金玉，夏潤福，等.脊髓損傷膠質(zhì)瘢痕形成及星形膠質(zhì)細胞作用的研究與轉(zhuǎn)化意義[J].中國組織工程研究，2016，20（37）：5609-5616.

[22]王一吉，周紅俊，衛(wèi)波，等.兒童脊髓損傷275例人口學與損傷特點[J].中華實用兒科臨床雜志，2015，30（23）：1798-1800.

[23]賀寶榮，許正偉，郝定均，等.下頸椎骨折脫位并脊髓損傷的前路手術(shù)治療[J].中國脊柱脊髓雜志，2013，23（7）：606-609.