奈達鉑與鼻咽癌相關蛋白P53、Bcl-2、caspase的表達水平與相關性分析

李燕 李嶸

·論著·

奈達鉑與鼻咽癌相關蛋白P53、Bcl-2、caspase的表達水平與相關性分析

李燕 李嶸

目的 觀察奈達鉑對鼻咽癌CNE-2細胞增殖和凋亡的影響，探討奈達鉑與鼻咽癌相關蛋白P53、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、caspase的表達水平與相關性分析。方法 分析不同濃度的奈達鉑(0 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml)和作用不同時間(12 h、24 h、36 h、48 h)對鼻咽癌CNE-2細胞增殖和凋亡的影響；分析不同濃度的奈達鉑對CNE-2細胞P53、Bcl-2、caspase蛋白表達水平的影響。結果 使用MTT法檢測不同濃度的奈達鉑對CNE-2細胞增殖的影響，隨奈達鉑濃度的升高OD值逐漸降低(P<0.05)，且隨著奈達鉑作用時間的延長OD值逐漸降低(P<0.05)。形態學可見：奈達鉑濃度0μg/ml時CNE-2細胞增值迅速、細胞飽滿，形態規則；奈達鉑作用下細胞增值減慢，細胞變圓、邊緣模糊；使用流式細胞儀檢測不同濃度的奈達鉑對CNE-2細胞凋亡率可見隨著奈達鉑濃度的升高細胞凋亡率逐漸升高(P<0.05)；使用免疫組化光密度定量檢測不同濃度的奈達鉑對CNE-2細胞P53、Bcl-2、caspase蛋白表達水平的影響，可見隨著奈達鉑濃度的升高P53、Bcl-2蛋白表達水平逐漸降低(P<0.05)，caspase蛋白表達水平逐漸升高(P<0.05)。結論 奈達鉑能夠明顯抑制鼻咽癌CNE-2細胞增殖和促進凋亡，其可能與抑制P53、Bcl-2蛋白表達和促進caspase蛋白表達有關。

奈達鉑；鼻咽癌CNE-2細胞；細胞增殖；細胞凋亡；P53；Bcl-2；caspase

鼻咽癌為臨床上較為常見的頭頸外科惡性腫瘤，近年來由于環境污染、生活習慣等的改變，鼻咽癌的發生率呈現出了逐年上升的趨勢。相關臨床研究表明鼻咽的發病率可達0.5%以上，且近三年來其局部地區的發病率更高[1]。對于Ⅲ期以及Ⅳ期的鼻咽癌患者，手術難以徹底切除病灶，此時通過聯合放化療治療可以有效改善臨床癥狀、延長生存時間[2,3]。奈達鉑是近年來應用較廣的細胞毒性藥物，在乳腺癌、鼻咽癌以及卵巢癌或者宮頸癌等惡性腫瘤的中晚期化療治療中具有顯著的臨床效果，規范的奈達鉑聯合化療的總體有效率可達65%以上，其術后平均生存時間可延長4～6個月[4]。然而迄今為止對于奈達鉑的作用機制的研究仍然不足，P53、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、caspase等因子廣泛參與到了惡性腫瘤的細胞增殖、凋亡和分化等病理過程，在影響細胞周期、提高細胞凋亡率進而增強化療藥物的敏感性方面具有重要的作用[5,6]，本研究重在探討奈達鉑作用于鼻咽癌細胞CNE-2后相關信號分子的變化，進而進一步揭示奈達鉑治療鼻咽癌的機制，為后續鼻咽癌的臨床治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人鼻咽癌細胞株CNE-2來自于華中科技大學同濟醫學院病理實驗室保存。

1.2 細胞增殖測量方法 鼻咽癌CNE-2細胞生長至融合度為90%時，用胰蛋白酶EDTA消化液消化細胞，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，24 h后加入奈達鉑，使之濃度梯度分別為0 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml，并設置6復孔，在37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中共培養，24 h后每孔加入10 μl新型細胞增殖及毒性檢測溶液CCK-8(南京凱基生物科技發展有限公司 KGA317)，酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度OD值。

1.3 細胞凋亡率測量方法 鼻咽癌CNE-2細胞生長至融合度為90%時用胰蛋白酶消化液(不含EDTA)消化細胞，離心收集細胞后用PBS洗滌細胞1次(2 000 r/min，5 min)，300 μl的1×Binding Buffer懸浮細胞，之后加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min，上機前5 min再加入5 μl的PI染色，避光放置10 min，流式細胞儀檢測4組凋亡率。流式細胞儀器FASC-990購自美國ABI公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，配套試劑購自羅氏檢測公司。

1.4 P53、Bcl-2、caspase蛋白表達水平定量分析方法 ELISA法檢測 P53、Bcl-2、caspase蛋白細胞消化離心后采用南京凱基生物有限公司生產HSD細胞裂解液裂解細胞，1 000 r/min離心后獲取上層清液，4℃保存待測，以標準品稀釋液將標準品復溶，靜置15 min后混勻，背比稀釋為7個濃度，取出板條，除了對照孔外每個孔加入不同濃度的標準品，劑量為100 μl/孔，采用封板蓋封住，室溫反應120 min，使用PBS液體洗滌3次，除了空白對照孔，每孔加入檢測液(100 μl)，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，加入底物(50 μl/孔)，避光孵育25 min，加入終止液5 min后測定450 nm處吸光度。 P53、Bcl-2、caspase蛋白抗體購自羅氏檢測公司，相關配套試劑購自南京凱基生物科技有限公司，嚴格按照說明書的要求進行操作。

1.5 觀察指標 比較不同濃度的奈達鉑(0、5、10、20 μg/ml)作用24 h后對CNE-2細胞增殖的影響；比較10 μg/ml奈達鉑作用不同時間(12、24、36、48 h)對CNE-2細胞增殖的影響；比較不同濃度的奈達鉑(0、5、10、20 μg/ml)作用24 h后對CNE-2細胞凋亡率的影響；比較不同濃度的奈達鉑(0、5、10、20 μg/ml)對CNE-2細胞P53、Bcl-2、caspase蛋白表達水平的影響。

2 結果

2.1 不同濃度奈達鉑對CNE-2細胞增值的影響 使用MTT法檢測不同濃度的奈達鉑刺激CNE-2細胞24h后的OD值，奈達鉑濃度0μg/ml時OD值為(0.95±0.07)，5μg/ml的OD值為(0.73±0.05)，10μg/ml的OD值為(0.68±0.06)，20μg/ml的OD值為(0.59±0.04)，可見隨著奈達鉑濃度的升高OD值逐漸降低，奈達鉑可明顯抑制CNE-2細胞的增值(P<0.05)。形態學可見：奈達鉑濃度0μg/ml時CNE-2細胞增值迅速、細胞飽滿，形態規則；奈達鉑作用下細胞增值減慢，細胞變圓、邊緣模糊。見表1，圖1～4。

表1 不同濃度奈達鉑對CNE-2細胞增值的影響 ±s

注：與對照組比較,*P<0.05；與5μg/ml組比較,#P<0.05；與10μg/ml組比較,△P<0.05

2.2 不同濃度MMC對肝干細胞的細胞毒作用比較 用10μg/ml奈達鉑分別作用12h、24h、36h、48h，使用MTT法檢測其OD值分別為(0.84±0.06)、(0.75±0.08)、(0.38±0.04)、(0.31±0.03)，結果可見隨著奈達鉑作用時間的延長OD值逐漸降低(P<0.05)。見表2。

2.3 不同濃度奈達鉑對CNE-2細胞凋亡程度的影響 使用流式細胞儀檢測不同濃度的奈達鉑刺激CNE-2細胞24h后的細胞凋亡率，奈達鉑濃度0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的細胞凋亡率分別為(0.65±0.01)%，(19.82±1.58)%，(40.60±5.46)%，(67.28±1.14)%，可見隨著奈達鉑濃度的升高細胞凋亡率逐漸升高，奈達鉑可明顯抑制CNE-2細胞的增值(P<0.05)。見表3。

圖1 奈達鉑濃度0μg/mlCNE?2細胞形態學變化(龍膽紫×400) 圖2 奈達鉑濃度5μg/mlCNE?2細胞形態學變化(龍膽紫×400) 圖3 奈達鉑濃度10μg/mlCNE?2細胞形態學變化(龍膽紫×400) 圖4 奈達鉑濃度20μg/mlCNE?2細胞形態學變化(龍膽紫×400)

表2 奈達鉑作用不同時間對CNE-2細胞增值的影響 ±s

注：與12h比較,*P<0.05；與24h比較，#P<0.05

表3 不同濃度奈達鉑對CNE-2細胞凋亡的影響 ±s

注：與對照組比較,*P<0.05；與5μg/ml組比較,#P<0.05；與10μg/ml組比較,△P<0.05

2.4 不同濃度奈達鉑對P53、Bcl-2、caspase蛋白表達水平的影響 使用免疫組化光密度測定定量檢測不同濃度的奈達鉑對CNE-2細胞P53、Bcl-2、caspase蛋白表達水平的影響，可見隨著奈達鉑濃度的升高P53、Bcl-2蛋白表達水平逐漸降低(P<0.05)，caspase蛋白表達水平逐漸升高(P<0.05)。見表4。

組別P53(OD值)Bcl?2(OD值)Caspase(OD值)對照組(0μg/ml)0．38±0．070．32±0．050．17±0．035μg/ml組0．29±0．05?0．25±0．04?0．24±0．05?10μg/ml組0．21±0．06?#0．20±0．04?#0．28±0．04?#20μg/ml組0．18±0．03?#△0．15±0．02?#△0．35±0．06?#△ F值10．8127．6298．547 P值<0．01<0．01<0．01

注：與對照組比較,*P<0.05；與5μg/ml組比較,#P<0.05；與10μg/ml組比較,△P<0.05

3 討論

鼻咽癌是指發生于鼻咽腔頂部和側壁的惡性腫瘤，是我國高發惡性腫瘤之一，發病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首。常見臨床癥狀為鼻塞、涕中帶血、耳悶堵感、聽力下降、復視及頭痛等。鼻咽癌大多對放射治療具有中度敏感性，放射治療是鼻咽癌的首選治療方法，但對于35%左右的臨床分期為Ⅲ期或者更晚期的患者，往往需要聯合奈達鉑進行聯合化療，進而促進殘留鼻咽癌病灶的細胞壞死和凋亡，延長放療后的生存時間[4]。臨床上通過前鼻鏡、鼻咽鏡或者磁共振檢查均有利于發現早期病變，從而有利于早期手術或者放療治療。一項匯集了45例鼻咽癌調強放療的相關臨床治療效果的分析可見，聯合靜脈奈達鉑化療的總體有效率可上升15%，患者5年內的病死率可下降5%左右[7,8]，但同時研究者在隨訪化療的過程中發現，部分鼻咽癌患者化療后再次進行手術的患者，其術后病灶病理切片免疫組化可見明顯的細胞凋亡相關蛋白以及癌基因編碼的相關蛋白的異常表達[9,10]。隨著近年來對于腫瘤分子生物學研究的進展，以及腫瘤免疫靶向治療研究的廣泛開展，對于鼻咽癌患者化療過程中相關信號分子的研究，將為后續腫瘤分子免疫靶向治療提供新的免疫靶向位點。

P53是一個重要的抗癌基因使癌細胞凋亡，從而防止癌變，還具有幫助細胞基因修復缺陷的功能，通過磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻譯后修飾調控，P53可以增強其對于鼻咽癌細胞周期的調節，進而抑制細胞過度增殖[11]；Bcl-2基因可以抑制由多種細胞毒因素所引起的細胞死亡，Bcl-2的過度表達能增強所觀察細胞對大多數細胞毒素的抵抗性，抑制細胞凋亡、促進腫瘤細胞的過度增殖和耐藥[12]；caspase能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基上的肽鍵，caspase負責選擇性地切割某些蛋白質，從而造成細胞凋亡。相關研究證實P53、Bcl-2以及caspase在卵巢癌、乳腺癌等中存在異常表達[13]，但在鼻咽癌CNE-2中的研究不足，本次研究的創新性在于首次探討了奈達鉑影響下的CNE-2的相關信號分子的變化。

使用MTT法檢測不同濃度的奈達鉑刺激CNE-2細胞24h后的OD值，發現隨著奈達鉑作用濃度的增加，鼻咽癌細胞CNE-2的增殖明顯減緩，OD值持續性下降，同時本次試驗研究中通過動態隨訪不同時間節點的奈達鉑作用效果，發現48h后的CNE-2細胞的OD值最低僅為(0.31±0.03)，此時奈達鉑抑制鼻咽癌細胞的作用最為明顯，表明奈達鉑對于CNE-2的抑制作用具有明顯的濃度和時間依賴性。光鏡下觀察可見，在奈達鉑的作用下，CNE-2細胞形態發生了明顯的變化，失去了原有的形態結構，細胞周邊變得粗糙而失去極性。Liu等[14,15]分析了奈達鉑作用下CNE-2的細胞增殖率的變化，發現5μg/ml的奈達鉑與CNE-2細胞在37℃的培養箱中共培養12h的細胞增殖抑制率可達15%，且隨著共培養時間的延長，細胞抑制率更高，OD值更低，結論與本研究較為一致。本研究通過流式細胞技術測定細胞凋亡率發現，奈達鉑濃度 0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml，20μg/ml時CNE-2的細胞凋亡率可持續性上升至80%左右，表明在一定范圍內增加奈達鉑的濃度可以促進鼻咽癌細胞的凋亡。更為重要的是，本研究對于腫瘤相關信號分子的研究發現，在奈達鉑的作用下，P53、Bcl-2蛋白表達水平逐漸降低，caspase蛋白表達水平逐漸升高，統計學差異較為明顯，其中P53可下降至(0.18±0.03)，而caspase蛋白可上升至0.35左右，表明奈達鉑可以通過上調有活性的caspase家族蛋白，抑制P53蛋白的表達，從而參與P53/caspase信號通路的調控，促進細胞凋亡、抑制鼻咽癌細胞的過度增殖，其中P53蛋白表達的抑制可以進一步調節鼻咽癌CNE-2細胞G1/S期細胞比值，進而抑制細胞快速通過G0期的速度，抑制癌細胞的過度增殖。

綜上所述，奈達鉑能夠明顯的抑制鼻咽癌CNE-2細胞增殖和促進凋亡，其可能與抑制P53、Bcl-2蛋白表達和促進caspase蛋白表達有關。通過對于鼻咽癌細胞CNE-2相關信號分子的研究將為后續免疫靶向治療提供新的作用靶點。

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Experimental study on the effects of nedaplatin on expression levels of nasopharyngeal carcinoma related proteins-P53,Bcl-2,caspase

LIYan,LIRong.
DepartmentofOncology,People’sHospitalofMeishanCity,Sichuan,Meishan620010,China

Objective To observe the effects of nedaplatin on cell proliferation and apoptosis of nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells (NPC CNE-2),and to explore the correlation between nedaplatin and the expression levels of nasopharyngeal carcinoma related proteins-P53,Bcl-2,caspase.Methods The effects of nedaplatin on cell proliferation and apoptosis of nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells in different concentrations (0μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml) and in different action time points (12h,24h,36h,48h) were detected by MTT and flow cytometry,respectively. Moreover the effects of nedaplatin on expression levels of P53,Bcl-2,caspase of CNE-2 cells in different concentrations were detected by immunohistochemisty.Results MTT examination results showed that with increase of concentrations of nedaplatin,OD values of CNE-2 cell proliferation were gradually decreased (P<0.05),moreover,withtheprolongationofactiontimeofnedaplatin,theODvaluesweregraduallydecreased(P<0.05).Inconcentrationsofnedaplatin0μg/ml,theCNE-2cellproliferationwasfaster,cellswerefullandcellmorphouswasregular,however,withincreaseofconcentrationsofnedaplatin,cellproliferationwasgraduallydecreased,cellbecameround,withedgeunsharpness.Theflowcytometrydetectionresultsshowedthatwithincreaseofconcentrationsofnedaplatin,theapoptoticrateofCNE-2cellswasgraduallyincreased(P<0.05).Theimmunohistochemistyresultsshowedthatwithincreaseofconcentrationsofnedaplatin,expressionlevelsofP53,Bcl-2weregraduallydecreased(P<0.05),however,the expression levels of caspase were gradually increased (P<0.05).Conclusion The nedaplatin can obviously inhibit the cell proliferation and promote cell apoptosis of NPC CNE-2 cells,which may be correlated to its effects of inhibiting the expressions of p53 and bcl-2 protein and promoting the expression of caspase protein.

nedaplatin; nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells; cell proliferation; cell apoptosis; P53; Bcl-2; caspase

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.09.001

620010 四川省眉山市人民醫院腫瘤科

R

A

1002-7386(2017)09-1285-04

2016-11-21)