腦血通片對腦缺血損傷的保護作用

陳力 童志遠 王丹 徐彭

·論著·

腦血通片對腦缺血損傷的保護作用

陳力 童志遠 王丹 徐彭

目的 觀察腦血通片對腦缺血損傷的保護作用并探討其作用機制。方法 采用小鼠全腦缺血、小鼠雙側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)結(jié)扎、小鼠全腦缺血再灌注、大鼠急性不完全腦缺血及膠原蛋白-腎上腺素混合誘導劑誘導的小鼠肺血栓實驗模型，觀察腦血通低劑量組(NXT-L組)與腦血通高劑量組(NXT-H組)，對腦缺血損傷的保護作用。結(jié)果 NXT-H延長小鼠斷頭喘息的存活時間為(23.26±1.76)s；NXT-L與NXT-H延長小鼠雙側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)結(jié)扎后的死亡時間分別為：(128.33±3.11)s、(1316±7.67)s ；NXT-H可以升高小鼠全腦缺血再灌注模型SOD值為：(150.02±18.51)U/mgprot；NXT-L與NXT-H降低小鼠全腦缺血再灌注模型MDA值分別為：(26.80±1.92)nmol/mgprot、(26.43±1.90)nmol/mgprot；NXT-L與NXT-H降低急性不完全腦缺血模型MDA值分別為：(6.36±1.67)nmol/mgprot、(5.78±0.90)nmol/mgprot；NXT-H降低腦指數(shù)為：(0.71±0.04)%；NXT-H降低膠原蛋白-腎上腺素混合誘導劑誘導的小鼠肺血栓實驗模型中小鼠死亡數(shù)+偏癱未恢復數(shù)為：(2+9=11)只。結(jié)論 NXT可以通過升高SOD活性，降低MDA的生成，降低腦血管通透性，發(fā)揮對腦組織的保護作用；可以降低膠原蛋白-腎上腺素混合誘導劑誘導的小鼠肺血栓實驗模型中小鼠死亡數(shù)+偏癱未恢復數(shù)。

腦血通；腦缺血

腦血通片是醫(yī)院由臨床經(jīng)驗方逐步發(fā)展起來的自制制劑，具有活血化瘀、通絡止痛的效果。主要用于腦動脈硬化和腦血管痙攣所致的血管性頭痛。從目前醫(yī)院使用腦血通片治療的患者療效來看，雖然腦血通片具有臨床療效顯著，不良反應較少的優(yōu)點。但腦血通的相關(guān)臨床研究資料較少，藥效學資料支持不足，成為阻礙腦血通片進一步發(fā)展的屏障。在院級課題(NO：CYFY13DL-007)資助下，本文將已完成的部分藥效學實驗結(jié)果，報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 腦血通片：成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院自制制劑，批號20130723，規(guī)格：0.4 g×100片。步長腦心通膠囊：陜西步長制藥有限公司，規(guī)格：0.4 g×36粒。阿司匹林腸溶片：石家莊康力藥業(yè)有限公司，規(guī)格：25 mg×100片。鹽酸腎上腺素注射液：天津金耀氨基酸有限公司，規(guī)格：1 ml∶1 mg。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)：規(guī)格：500 g。SOD試劑盒(100T/96樣)：南京建成生物工程研究所。MDA試劑盒(100T/96樣)：南京建成生物工程研究所。考馬斯亮藍試劑盒(100T/96樣)：南京建成生物工程研究所。冰乙酸：AR級。無水乙醇:AR級。

1.2 儀器 可見分光光度計：722型；離心機：Certrifuge5702；電熱恒溫培養(yǎng)箱：TSTP2500；電熱恒溫水浴鍋：HH.S11-Ni22；純水機：Milli-Q Direct8；千分之一電子天平：METTER-TOLEDO，型號，PL203；萬分之一電子天平：Sartorius，型號，BS 124S；電動玻璃組織勻漿機:寧波新芝生物科技股份有限公司，型號，DY89-1。

1.3 實驗動物 昆明種小鼠，雌雄各半，18～22 g，四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所中心提供，動物合格證號：SCXK(川)2013-15。SD大鼠，雌雄各半，190～240 g，由四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所中心提供，動物合格證號：SCXK(川)2013-15。所有實驗動物置于恒溫、恒濕的飼養(yǎng)條件下，固體飼料，自由飲水。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠全腦缺血實驗[1]：小鼠40只，體重18～22 g，雌雄各20只，隨機分為4組[CMC空白組，腦血通片低劑量組，腦血通片高劑量組，陽性對照組(步長腦心通組)]，每組10只。4組分別灌胃給予相應藥物，且按相應劑量連續(xù)給藥15 d，于末次給藥30 min后，迅速從小鼠雙耳后頸部處斷頭，采用雙盲法觀察小鼠喘息時間(以小鼠最后一次喘息抽搐的時間為止)。

1.4.2 小鼠雙側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)結(jié)扎實驗[2,3]：小鼠40只，體重18～22 g,雌雄各20只，隨機分為4組[CMC空白組，腦血通片低劑量組，腦血通片高劑量組，陽性對照組(步長腦心通組)]，每組10只。4組分別灌胃給予相應藥物，且按相應劑量連續(xù)給藥15 d，于末次給藥30 min之后，用水合氯醛麻醉動物，分離雙側(cè)頸總動脈和伴行的迷走神經(jīng)，用手術(shù)線同時結(jié)扎，記錄小鼠的存活時間。

1.4.3 小鼠全腦缺血再灌注的影響實驗[4,5]：小鼠50只，體重18～22 g，雌雄各20只，隨機分為5組[腦血通片低劑量組、腦血通片高劑量組、CMC假手術(shù)對照組、CMC手術(shù)對照組、陽性對照組(步長腦心通組)]，每組10只。且按相應劑量連續(xù)給藥15 d，于末次給藥1 h后，用1%水合氯醛麻醉，頸部正中切口，分離頸總動脈，用棉線系活結(jié)結(jié)扎，造成急性全腦缺血損傷模型，阻斷20 min后再灌20 min，再阻斷20 min，解開結(jié)扎線，縫合切口，待小鼠恢復后，繼續(xù)置于25℃恒溫空調(diào)房內(nèi)飼養(yǎng)，24 h后處死老鼠，取腦組織，用冰0.9%氯化鈉溶液制成10%組織勻漿，按試劑盒說明書推薦的方法，分別測定超氧化物歧化酶(SOD)與丙二醛(MDA)的含量。

1.4.4 大鼠急性不完全腦缺血實驗[6-8]：大鼠50只，體重180～220 g，雌雄各25只，隨機分為5組[腦血通片低劑量組、腦血通片高劑量組、CMC假手術(shù)對照組、CMC手術(shù)對照組、陽性對照組(步長腦心通組)]，每組10只。且按相應劑量連續(xù)給藥15 d，于末次給藥30 min后，以異氟烷呼吸麻醉10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(350 mg/kg)，手術(shù)結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，造成急性不完全腦缺血模型，假手術(shù)組僅分離頸總動脈。術(shù)后3 h斷頭處死動物，取腦組織，稱重，計算腦指數(shù)。以大腦縱裂沿矢狀縫為標志，將腦分成左右兩部分，稱左半腦濕重，置110℃烘箱中48 h后，稱其干重，計算左半腦組織的含水量，余下右半腦，分別用冰的0.9%氯化鈉溶液制成10%的組織勻漿，按試劑盒說明書推薦的方法分別測定SOD和MDA含量。

1.4.5 膠原蛋白-腎上腺素混合誘導劑誘導的小鼠肺血栓實驗[9-11]：小鼠48只，體重20～22 g，雌雄各24只，隨機分為4組[腦血通片高劑量組、腦血通片低劑量組、CMC空白對照組、陽性對照組(阿司匹林腸溶片組)]；每組12只，雌雄各6只。4組連續(xù)給藥15 d，于最后一次給藥30 min后，尾靜脈注射膠原與腎上腺素的混懸液0.2 ml/只，按文獻[9]方法制備膠原與腎上腺素的混懸液：取脫毛的大鼠腹部皮膚，按0.1 g加入1 ml 0.9%氯化鈉溶液，利用組織勻漿機將其研碎，再以3 000 r/min，離心10 min，取上清液，加入腎上腺素，使其含量為2 μl/ml。尾靜脈注射膠原與腎上腺素混懸液后能造成小白鼠體內(nèi)肺血栓模型，觀察注入膠原蛋白-腎上腺素混懸液后，分別記錄5 min內(nèi)小白鼠死亡和15 min內(nèi)偏癱未恢復的動物數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 腦血通片對小鼠全腦缺血死亡時間的保護實驗 與CMC空白組比較，腦血通片高劑量組和步長腦心通組小鼠的全腦缺血喘息時間明顯延長(P<0.05)。與CMC空白組比較，腦血通片低劑量組小鼠的全腦缺血時的喘息時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 腦血通片對結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)的保護實驗 與CMC空白組比較，腦血通片低劑量組和腦血通片高劑量組均能延長結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)小鼠的存活時間(P<0.05)。見表2。

表1 腦血通片對小鼠全腦缺血時的喘息時間影響 ±s

注：與CMC空白組比較，*P<0.05

表2 腦血通片對結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)時小鼠的存活時間影響 ±s

注：與CMC空白組比較，*P<0.05，#P<0.01

2.3 腦血通片對小鼠全腦缺血再灌注的保護實驗 與CMC手術(shù)組比較，腦血通片低劑量組能降低MDA值(P<0.05或<0.01),腦血通片高劑量組能升高SDO值(P<0.05或<0.01)，并降低MDA值。見表3。

表3 腦血通片對小鼠全腦缺血再灌注時腦組織勻漿中SOD和MDA含量的影響 ±s

注： 與CMC假手術(shù)組比較，*P<0.05，#P<0.01;與CMC手術(shù)組比較，△P<0.05，☆P<0.01

2.4 腦血通片對大鼠急性不完全腦缺血的保護實驗 與CMC手術(shù)組比較，腦血通片高劑量組能夠降低大鼠急性不完全腦缺血時的腦指數(shù)(P<0.05或<0.01)。腦血通片高劑量組與低劑量組都能降低腦勻漿中的MDA值，但2個劑量組對SOD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4、5。

表4 腦血通片對大鼠急性不完全腦缺血時的腦指數(shù)的影響 ±s

注： 與CMC假手術(shù)組比較，*P<0.05;與CMC手術(shù)組比較，#P<0.05，△P<0.01

表5 腦血通片對大鼠急性不完全腦缺血時腦組織勻漿中SOD和MDA含量的影響 ±s

注： 與CMC假手術(shù)組比較，*P<0.05;與CMC手術(shù)組比較，#P<0.05，△P<0.01

2.5 腦血通片對膠原蛋白-腎上腺素混合誘導劑誘導的小鼠肺血栓實驗 與CMC空白組比較，腦血通高劑量組可以降低誘導劑誘導的小鼠肺血栓實驗的死亡數(shù)和偏癱未恢復數(shù)(P<0.05或<0.01)。見表6。

表6 腦血通片對混合誘導劑誘導的小鼠肺血栓實驗的死亡數(shù)和偏癱未恢復數(shù) n=12

注：與CMC空白組比較，*P<0.05，#P<0.01；死亡數(shù)在最后統(tǒng)計時也應算進偏癱未恢復數(shù)里面

3 討論

在我國，腦血管疾病與心臟病和癌癥，構(gòu)成了危害人類健康的三大主要疾病[12]。由于腦血管疾病的發(fā)病率和年齡增長呈正相關(guān)趨勢，其已成為我國中老年人致殘和死亡的主要原因之一。

腦缺血是由于各種原因引發(fā)的腦動脈管腔狹窄或堵塞，造成局部腦血流量突然減少或中斷，導致該動脈供應區(qū)的腦組織供血、供氧、供能減少，繼而引起繼發(fā)性的血管內(nèi)皮損傷和自主神經(jīng)功能障礙的一種病理狀態(tài)。該狀態(tài)持續(xù)一段時間后，可出現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)的腦組織壞死和細胞死亡。

腦缺血后，會引起機體一系列損傷反應。主要表現(xiàn)為：(1)短時間缺血的急性損傷[13]。此時腦部神經(jīng)細胞出現(xiàn)急性壞死，能量代謝出現(xiàn)異常，氧自由基增多。(2)缺血后再灌注的延遲性損傷。此時由于長時間的缺血，觸發(fā)了繼發(fā)性的損傷機制，神經(jīng)細胞損傷加重，缺血范圍逐漸增大。雖然再灌注時候，腦部會恢復一部分的氧氣供應，但是由于急性缺血時期抗氧化酶類的大量消耗，因此導致氧自由基進一步增加；同時增加的氧自由基還可以與生物膜上的脂類物質(zhì)反應形成多種脂質(zhì)過氧化物，破壞腦毛細血管內(nèi)皮細胞，引起膜的流動性和通透性發(fā)生改變，使細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損，從而影響水電解質(zhì)的平衡及膜的穩(wěn)定性[14,15]。

腦血通片是我院目前治療腦血管相關(guān)疾病的自制制劑。方中川芎能活血行氣以通氣滯，廣泛用于各種瘀血痹痛、丹參活血化瘀，作用溫和，不易傷陰血，有利于營血的新生；白芷、蔓荊子、藁本等疏風止痛，以消瘀血、痰濁所致之清竅不利；蜈蚣、全蝎相須為用，通絡止痛；土鱉蟲活血通經(jīng)，息風通絡，以消瘀血所阻之脈絡。全方組方科學，合理共同發(fā)揮奏疏風通絡、活血行氣的功效。在我院使用廣泛，患者反應較好。

根據(jù)實驗結(jié)果可知：腦血通片可以延長小鼠斷頭喘息的存活時間(高劑量組，P<0.01)；也能延長小鼠雙側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)結(jié)扎后的死亡時間(低劑量組，P<0.05；高劑量組，P<0.01)。該研究從整體實驗動物的角度，確定了腦血通片對腦缺血損傷的保護作用。

實驗也表明：腦血通片在缺血再灌注期(小鼠全腦缺血再灌注試驗)中可以通過升高SOD活性(高劑量組，P<0.01)，降低氧自由基的生成(高劑量組，P<0.01)；也能降低急性損傷期大鼠腦血管通透性，降低腦指數(shù)(高劑量組，P<0.05)；以及減少膠原蛋白與腎上腺素混合誘導劑所導致的小鼠肺血栓死亡有顯著的保護作用(高劑量組，P<0.05)，與相關(guān)文獻[16,17]結(jié)果表現(xiàn)一致；但是在大鼠急性不完全腦缺血實驗中，我們雖然觀察到了MDA值降低(低劑量組，P<0.05；高劑量組，P<0.01)，但檢測到SOD值升高差異無統(tǒng)計學意義(高劑量組與低劑量組均無顯著差異)，與文獻[18,19]結(jié)果不一致，提示腦血通片對急性腦缺血的保護作用仍有待進一步研究。此外，腦血通片對凝血機制和纖溶系統(tǒng)的影響也有待于后續(xù)試驗的進一步驗證。

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Experimental study on the protective effects of Naoxuetong tablets on cerebral ischemia in mice

CHENLi,TONGZhiyuan,WANGDan,etal.
TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

Objective To explore the protective effects and possible mechanism of Naoxuetong tablets on cerebral ischemia in mice.Methods The animal models were established including global brain ischemia models in mice, bilateral common carotid artery ligation and vagas nerve ligation models in mice,global brain ischemia-reperfusion (I/R) in mice, pulmonary embolism models in mice induced by collagen-epinephrine combination,and acute incomplete brain ischemia models in rats,then the protective effects of Naoxuetong low-dose group (NXT-L group) and Naoxuetong high-dose group (NXT-H group) on cerebral ischemia injury were observed.Results The lengthening survival time of decapitation gasping in mice of NXT-H group was (23.26±1.76)s,and the lengthening survival time after bilateral common carotid artery ligation and vagas nerve ligation in NXT-Lgroup and NXT-H group was (128.33±3.11)s,(1316±7.67)s,respectively.The levels of SOD were (150.02±18.51)U/mgprot in mice with global brain ischemia-reperfusion,which were increased by NXT-H,moreover, NXT-L and NXT-H decreased the MDA levels in mice with global brain ischemia-reperfusion by (26.80±1.92)nmol/mgprot,(26.43±1.90)nmol/mgprot,respectively. However NXT-L and NXT-H decreased the MDA levels in rats with incomplete brain ischemia-reperfusion by (6.36±1.67)nmol/mgprot,(5.78±0.90)nmol/mgprot,respectively. NXT-H could decrease cerebral index by (0.71±0.04)%,and the death number of mice+hemiplegia number (non-recovery) decreased by NXT-H were 11 mice (2+9) in mice models with pulmonary embolism induced by collagen-epinephrine combination.Conclusion NXT can produce protective effects on brain tissue of mice by increasing the activity of SOD, decreasing the production of MDA and reducing cerebral vascular permeability, moreover, which can decrease the death number of mice+hemiplegia number (non-recovery) in mice models with pulmonary embolism induced by collagen-epinephrine combination.

Naoxuetong;cerebral ischemia

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.09.005

項目來源：成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院院級課題項目(編號：CYFY13DL-007)

610500 成都市，成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院(陳力、童志遠、王丹)；江西中醫(yī)藥大學(徐彭)

徐彭，330004 南昌市，江西中醫(yī)藥大學；

E-mail:xp0420@163.com

R 743.31

A

1002-7386(2017)09-1301-04

2016-11-20)