逍遙丸對(duì)調(diào)節(jié)雄激素致排卵障礙模型大鼠卵巢氧化損傷和顆粒細(xì)胞凋亡的研究

郝明 周楠 杜惠蘭

·論著·

逍遙丸對(duì)調(diào)節(jié)雄激素致排卵障礙模型大鼠卵巢氧化損傷和顆粒細(xì)胞凋亡的研究

郝明 周楠 杜惠蘭

目的 觀察逍遙丸對(duì)雄激素致排卵障礙模型大鼠卵巢氧化損傷和顆粒細(xì)胞凋亡的影響。方法 60只9日齡SD雌性大鼠隨機(jī)選取20只為正常組，余40只皮下注射丙酸睪丸酮建立雄激素致排卵障礙模型大鼠模型，造模成功后，隨機(jī)分為模型組和逍遙丸治療組，每組20只，給藥5周，于動(dòng)情前期斷頭取血，比色法測(cè)定3組大鼠血清和卵巢T-AOC水平，硫代巴比妥法測(cè)定3組大鼠血清和卵巢MDA水平；免疫組化SP法檢測(cè)3組大鼠卵巢組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠血清和卵巢中T-AOC水平顯著降低，MDA水平顯著升高(P<0.05)，模型組卵巢顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)明顯高于正常組(P<0.01)。與模型組比較，逍遙丸治療組大鼠血清和卵巢中T-AOC水平升高，MDA水平降低(P<0.05)，逍遙丸治療組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)值顯著低于模型組(P<0.05)。結(jié)論 逍遙丸能夠改善排卵障礙疾病。

逍遙丸；雄激素；大鼠；卵巢

臨床中多囊卵巢綜合征、功血、閉經(jīng)、不孕癥等屬于無排卵或排卵障礙性疾病，主要是由于下丘腦-垂體-卵巢軸(HPOA)功能性或器質(zhì)性病變所導(dǎo)致。中醫(yī)認(rèn)為，女子以血為本，經(jīng)、孕、產(chǎn)、乳數(shù)傷于血。而肝主藏血，司血海，主疏泄。若肝血不足，肝失疏泄，則沖任失調(diào)為患，可導(dǎo)致月經(jīng)紊亂、不孕等。因此，臨床上運(yùn)用疏肝法治療排卵障礙性疾病療效顯著，逍遙丸具有疏肝理氣、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之功效，而成為疏肝法的代表藥物。研究表明排卵障礙的發(fā)生可能與卵巢的氧化損傷、細(xì)胞的凋亡可有關(guān)[1]。氧自由基(OFR)能破壞氧化與抗氧化平衡，自由基造成生物體系損傷的重要因素是產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，其中最主要的是丙二醛(malondialdehyde,MDA)[2-4]。總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)的作用主要是維持內(nèi)環(huán)境活性氧的動(dòng)態(tài)平衡，提高機(jī)體抗自由基能力、減少脂質(zhì)過氧化，使機(jī)體處于氧化還原相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，保護(hù)和改善細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性，起到調(diào)節(jié)組織細(xì)胞功能的作用。排卵障礙多表現(xiàn)為卵泡在排卵前的閉鎖，而卵泡閉鎖與卵巢卵泡細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的凋亡有關(guān)[5]。逍遙丸促排卵的作用是否跟調(diào)節(jié)卵巢氧化損傷和顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)，值得我們研究。本實(shí)驗(yàn)以雄激素致排卵障礙模型大鼠為研究對(duì)象，探討逍遙丸治療雄激素致排卵障礙性疾病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用同批出生9日齡健康雌性SD大鼠60只，體重約15 g，合格證號(hào)：812037，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 丙酸睪丸酮注射，天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，合格證號(hào)：0203232。逍遙丸，廣西梧州三鶴藥業(yè)有限公司，將200丸(每8丸相當(dāng)于生藥3 g)逍遙丸溶于125 ml蒸餾水中制成混懸液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑及儀器 總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Caspase-3免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。以上試劑盒不與其他細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。高速冷凍離心機(jī)：DL-5 000 B，上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱：HHB11360，天津三水科學(xué)儀器有限公司；OLYMPUS顯微照相機(jī)：C-35AD-2，日本；721分光光度計(jì)：上海第三分析儀器廠產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物模型及分組:參照俞瑾等[6]方法，將9日齡同批出生SD雌性大鼠60只，隨機(jī)選取40只于頸背部皮下注射丙酸睪丸酮0.05 ml/只(1.25 mg/只)，第70日齡時(shí)行陰道脫落細(xì)胞涂片，當(dāng)陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化時(shí)提示造模成功。其余20只，于頸背部皮下一次性注射中性茶油0.05 ml作為正常組。40只造模成功的大鼠，隨機(jī)分為模型組和逍遙丸治療組，每組20只。遙丸治療組:每日灌服逍遙丸5 ml(5.3 g/ml/100 g體重，相當(dāng)于臨床劑量20倍)，正常組和模型組灌服等劑量蒸餾水，每天1次，連續(xù)灌胃5周。

1.4.2 動(dòng)物一般狀況:每周測(cè)量大鼠體重，觀察3組大鼠一般情況，包括形體、發(fā)育、活動(dòng)、神態(tài)、攝食量、毛色等并做記錄，處死前稱重。

1.4.3 大鼠陰道上皮細(xì)胞檢查:3組分別于給藥5周后每天上午做陰道涂片1次，連續(xù)2個(gè)性周期(處死前2 d，每隔2 h涂片1次以確定動(dòng)情周期)，以5%的堿性美藍(lán)溶液染色10 min，自來水輕輕洗去多余的染色液，待干，用普通光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4.4 3組大鼠血清中MDA、T-AOC的檢測(cè):最后一次給藥后禁食8 h，選擇動(dòng)情前期，斷頭法取血，制備血清。應(yīng)用硫代巴比妥法測(cè)定3組大鼠血清MDA水平，取3組大鼠血清，按照說明要求分別加入試劑后95°沸水浴40 min，取出后流水冷卻，4 000 r/min離心10 min 后取上清，532 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各組吸光度值，血清中MDA含量(nmol/ml)=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/ml)×標(biāo)本稀釋前稀釋倍數(shù)。應(yīng)用比色法測(cè)定3組大鼠血清T-AOC水平，3組大鼠血清按說明加入試劑后，于旋渦混勻器充分混勻放置10 min，蒸餾水調(diào)零，1 cm光徑，520 nm測(cè)出3組吸光度，血清中T-AOC含量(單位/毫升血清)=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/0.01/30×反應(yīng)液總體積(ml)/取樣量(ml)×標(biāo)本稀釋前稀釋倍數(shù)。

1.4.5 3組大鼠卵巢組織中MDA、T-AOC的檢測(cè):將3組大鼠卵巢于冰盤上剪碎，取剪碎組織1 g研磨至勻漿，4 000 r/min離心10 min后取上清液。應(yīng)用硫代巴比妥法測(cè)定各組大鼠卵巢MDA水平，方法同前，卵巢組織中MDA(nmol/mg)=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/ml)/待測(cè)樣本蛋白濃度(mg/ml)。應(yīng)用比色法測(cè)定3組大鼠卵巢中T-AOC水平，雙蒸水調(diào)零，1 cm光徑，520 nm測(cè)出3組吸光度，卵巢組織中T-AOC含量(單位/毫克蛋白)=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/(0.01×30)×反應(yīng)液總體積(ml)/取樣量(ml)×標(biāo)本測(cè)試前稀釋倍數(shù)/待測(cè)樣本蛋白濃度(mg/ml)。

1.4.6 3組大鼠卵巢組織中Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測(cè):在冰盤上取下卵巢，分別置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，采用免疫組化SP法分析卵巢Caspase-3蛋白的表達(dá)，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以試劑公司提供的陽性對(duì)照切片作為陽性對(duì)照；染色判定：細(xì)胞膜上和胞質(zhì)中均出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，而且結(jié)構(gòu)清晰，著色明顯高于背景，顯色強(qiáng)度與背景無差別者或不著色為陰性表達(dá)。結(jié)果判讀：每張切片在200倍鏡下觀察全片，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)，分級(jí)如下：>50%為強(qiáng)陽性(+++)，25%～50%為陽性(++)，<25%為弱陽性(+)，無著色為陰性(-)，并采用Motic Images Advanced 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定灰度值，灰度值越低，蛋白表達(dá)含量越高

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般狀況 實(shí)驗(yàn)過程中，正常組和逍遙丸治療組大鼠均發(fā)育良好，毛色白而光澤，精神佳，活潑，反應(yīng)靈敏，飲食、大小便正常。模型組大鼠精神欠佳，反應(yīng)較遲鈍，體重增加。

2.2 陰道上皮細(xì)胞涂片 連續(xù)給藥5周后，正常組陰道細(xì)胞呈典型的周期性變化，即動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期；雄激素模型組陰道上皮細(xì)胞呈持續(xù)角化，逍遙丸治療組大部分大鼠陰道上皮細(xì)胞呈周期性變化。

2.3 3組大鼠血清中T-AOC、MDA水平比較 與正常組相比，逍遙丸治療組大鼠血清T-AOC、MDA水平恢復(fù)正常(P>0.05)，模型組大鼠血清T-AOC水平降低，血清MDA水平升高(P<0.05)；與模型組大鼠相比，逍遙丸治療組大鼠血清T-AOC水平升高，血清MDA水平降低(P<0.05)。見表1。

組別T?AOC(U/ml)MDA(nmol/ml)正常組4．67±1．221．87±0．46模型組3．15±0．34?2．57±0．75?逍遙丸治療組4．05±0．69#2．04±0．31#

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.4 3組大鼠卵巢中T-AOC、MDA水平比較 與正常組相比，逍遙丸治療組大鼠卵巢中T-AOC降低、MDA水平升高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組大鼠卵巢中T-AOC水平顯著降低，血清MDA水平顯著升高(P均<0.05)；與模型組大鼠相比，逍遙丸治療組大鼠血清T-AOC水平升高，血清MDA水平降低(P<0.05)。見表2。

2.5 3組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)與正常組比較，逍遙丸治療組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)高于正常組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組卵巢顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)明顯高于正常組(P<0.05)；與模型組比較，逍遙丸治療組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)值顯著低于模型組(P<0.05)。免疫組化結(jié)果表明，Caspase-3蛋白的表達(dá)主要位于細(xì)胞膜上和胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。Caspase-3蛋白在正常組染色較淺且顆粒細(xì)胞較多，只有少數(shù)呈粒狀著色，灰度值較高；在模型大鼠卵巢顆粒細(xì)胞上可以見到大部分色呈片狀或顆粒狀的Caspase-3蛋白，染色較深，提示模型組Caspase-3蛋白表達(dá)較強(qiáng)，灰度值較低；遙丸治療組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞不同程度變稀疏，體積稍增大，細(xì)胞胞漿內(nèi)片狀和顆粒狀的Caspase-3染色顆粒較模型組減少，顏色變淺。見表3，圖1。

組別T?AOC(U/ml)MDA(nmol/ml)正常組3．50±0．631．97±0．59模型組2．48±0．36?3．04±0．92?逍遙丸治療組2．92±0．42#2．48±0．64#

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別Caspase?3正常組150．7±6．8模型組111．6±9．5?逍遙丸治療組138．9±11．3#

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

模型組逍遙丸治療組正常組

圖1 4組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)(SP法×40)

3 討論

中醫(yī)諸多先賢論述，強(qiáng)調(diào)了肝在女性生殖功能方面的重要作用。如《景岳全書·婦人規(guī)》：“產(chǎn)育由于血?dú)猓獨(dú)庥捎谇閼眩閼巡粫硠t沖任不充，沖任不充則胎孕不受。”《婦人大全良方》曰：“……感憤而不得言，多有閉經(jīng)之虞。”《四圣心源》：“木氣之疏泄，崩漏之機(jī)也。”《濟(jì)陰綱目》：“情不宣暢，經(jīng)多不調(diào)，故難孕。”在《素問病機(jī)氣宜保命集·婦人胎產(chǎn)論》“婦人……天癸既行，皆從厥陰論之”，指出在生育年齡階段患病，多從肝調(diào)治。因此，臨床上運(yùn)用疏肝法治療月經(jīng)紊亂、不孕癥者比比皆是，而且療效顯著[7-10]。所以，我們認(rèn)為肝主疏泄，調(diào)暢氣機(jī)，是沖任二脈陰陽消長(zhǎng)轉(zhuǎn)化、卵子發(fā)育成熟并能順利排出的樞機(jī)。本實(shí)驗(yàn)確定以疏肝解郁作為排卵障礙性疾病的治療大法，逍遙丸是經(jīng)典的調(diào)經(jīng)方藥并在千百年來廣泛應(yīng)用于月經(jīng)病和不孕癥等無排卵疾病，并且有較好的療效。逍遙丸是在宋朝《太平惠民和劑局方》“逍遙散”的基礎(chǔ)上應(yīng)用現(xiàn)代生產(chǎn)工藝技術(shù)所制成的新型中藥制劑，此方由柴胡、茯苓、白術(shù)、當(dāng)歸、甘草等組成。本方原治肝郁脾虛血虛之證，為疏肝解郁、健脾養(yǎng)血、調(diào)和肝脾之常用方，因本方有疏肝解郁、養(yǎng)血活血之功，故選用逍遙丸作為疏肝解郁的代表方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

目前，關(guān)于排卵障礙的發(fā)生機(jī)制方面尚有許多不明之處。因此研究排卵障礙發(fā)生的機(jī)制，促進(jìn)卵泡發(fā)育，誘發(fā)排卵，長(zhǎng)期以來一直是婦科領(lǐng)域十分關(guān)注的課題，卵巢的氧化損傷和顆粒細(xì)胞凋亡可能與排卵障礙的發(fā)生有關(guān)[11,12]。目前越來越多的證據(jù)表明氧自由基(OFR)參與了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。OFR能破壞氧化與抗氧化平衡，且在細(xì)胞凋亡中起重要作用[13]。已知機(jī)體內(nèi)氧自由基能引發(fā)生物膜中脂質(zhì)過氧化作用,形成脂質(zhì)過氧化物，如MDA、酮基等，導(dǎo)致細(xì)胞代謝、功能和結(jié)構(gòu)的改變。自由基過度產(chǎn)生和消除能力下降是引起生物體病理性變化的不可忽視的因素。MDA具有很強(qiáng)的生物毒性，極易與磷脂蛋白發(fā)生反應(yīng)，改變細(xì)胞膜的通透性，而造成組織細(xì)胞的氧化損傷，體內(nèi)MDA的含量間接地反映細(xì)胞損傷的程度。T-AOC的作用主要是維持內(nèi)環(huán)境活性氧的動(dòng)態(tài)平衡，分解過高的自由基和活性氧，提高機(jī)體抗自由基能力、減少脂質(zhì)過氧化，使機(jī)體處于氧化還原相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，保護(hù)和改善細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性，起到調(diào)節(jié)組織細(xì)胞功能的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雄激素致無排卵模型大鼠的血漿和卵巢MDA含量明顯高于正常大鼠，血漿和卵巢的T-AOC含量明顯低于正常組，而經(jīng)過逍遙丸治療的大鼠其血漿和卵巢的MDA含量降低，血清和卵巢的T-AOC和膽紅素水平提高，推測(cè)氧化損傷、總抗氧化能力損傷可能是導(dǎo)致排卵障礙的重要因素之一。逍遙丸可能是通過提高HO-1活性，增加其代謝產(chǎn)物-膽紅素水平，進(jìn)而提高T-AOC的能力，從而減少卵巢組織的氧化損傷，促進(jìn)卵泡的發(fā)育成熟。

研究表明，當(dāng)幼齡雌性鼠給予外源性雄激素后，導(dǎo)致HPOA改變，使血清中黃體生成素(LH)/卵泡刺激素(FSH)在周期中比值升高，不能形成LH峰，故不能出現(xiàn)排卵，并且T升高時(shí),可直接作用于卵子,或影響內(nèi)膜的發(fā)育導(dǎo)致卵泡發(fā)育停滯閉鎖，引起排卵障礙[14,15]。另外，卵巢微環(huán)境由于雄激素的增加，損害卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，導(dǎo)致卵泡閉鎖。排卵障礙多表現(xiàn)為卵泡在排卵前的閉鎖，而卵泡閉鎖與卵巢卵泡細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的凋亡有關(guān)。凋亡蛋白質(zhì)酶是一類半胱氨酸蛋白質(zhì)酶，具有特異性水解底物分子天冬氨酸(Asp)殘七C端肽鍵功能，是近年隨著凋亡研究的深入而發(fā)現(xiàn)的重要凋亡分子，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用[16]。迄今已有13個(gè)分子得到命名，分別為凋亡蛋白質(zhì)酶1～13。其中凋亡蛋白質(zhì)-3(Caspase-3)是被認(rèn)為在多種組織、細(xì)胞類型中最常涉及的凋亡效應(yīng)分子。它在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮著重要的作用。Caspase-3正常以酶原的形式存在于細(xì)胞漿內(nèi)，在凋亡的早期階段被激活，活化的Caspase-3引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起細(xì)胞凋亡。因此，檢測(cè)Caspase-3的活性有助于發(fā)現(xiàn)早期的凋亡細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，逍遙丸可以不同程度上減少激素致無排卵模型大鼠卵巢中顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)，從而減少顆粒細(xì)胞的凋亡。我們推測(cè)，一方面逍遙丸可能是通過激活下丘腦、垂體負(fù)反饋機(jī)制，促進(jìn)E2、FSH的分泌，降低T、LH的分泌，從而調(diào)節(jié)性激素水平，調(diào)整模型大鼠卵巢組織中異常增高的Caspase-3蛋白的表達(dá)，減少顆粒細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)垂體及卵巢的反映性，改善性腺軸的功能，從而部分恢復(fù)卵巢的功能。另一方面逍遙丸的類激素作用直接作用于卵巢，調(diào)節(jié)卵巢組織Caspase-3蛋白水平及顆粒細(xì)胞的凋亡，提高卵巢對(duì)垂體分泌的性腺激素的反應(yīng)性，進(jìn)而調(diào)節(jié)性腺激素的分泌，增強(qiáng)腎-天癸-胞宮之間的功能。

綜上所述，逍遙丸重在疏肝理氣，通過改善排卵障礙模型大鼠卵巢的氧化損傷和卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)卵泡的發(fā)育、成熟及促進(jìn)排卵，肯定了逍遙丸在治療排卵障礙疾病的療效。

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HAOMing*,ZHOUNan,DUHuilan.
*DepartmentofObstetricsandGynecology,BethuneInternationalPeaceHospitalofPLA,Shijiazhuang050082,China

Objective To observe the effects of Xiaoyao pill (XYP) on ovarian oxidative damage and apoptosis of granulosa cells in androgen-induced sterile rats (ASR).Methods Forty female SD rats (9-day age) were randomly divided into control group (n=20)andmodelgroup(n=40).Theratmodelswithovulationfailure(ASR)wereestablishedbysubcutaneousinjectionwithtestosteronepropionate,aftermodeling,the40ratswererandomlydividedintomodelcontrolgroupandXiaoyaopilltreatmentgroup(medicationfor5weeks),with20ratsineachgroup.Thentheseratsweresacrificedandbloodspecimensweretaken,thelevelsofT-AOCinserumandovariantissueweredetectedbycolorimetry,andthelevelsofMDAinserumandovariantissueweredetectedbypenthiobarbitalmethod(TBA),andtheexpressionlevelsofCaspase-3proteinweredetectedbyimmunohistochemisty.Results As compared with those in control group, the levels of T-AOC in serum and ovarian tissue in model group were significantly decreased,however,the levels of MDA were significantly increased (P<0.05).TheexpressionlevelsofCaspase-3proteininovarygranulosacellsweresignificantlyhigherthanthoseincontrolgroup(P<0.01).Ascomparedwiththoseinmodelcontrolgroup,thelevelsofT-AOCinserumandovariantissueinXiaoyaopilltreatmentgroupweresignificantlyincreased,however,thelevelsofMDAweresignificantlydecreased(P<0.05),moreover,theexpressionlevelsofCaspase-3proteinofovarygranulosacellsinXiaoyaopilltreatmentgroupweresignificantlylowerthanthoseinmodelcontrolgroup(P<0.05).Conclusion XYP can improve follicular development and ovulation failure.

Xiaoyao pill;androgen;rats;ovary

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.09.008

050082 石家莊市，中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院婦產(chǎn)科(郝明);河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院婦一科(周楠)；河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院(杜惠蘭)

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1002-7386(2017)09-1312-05

2016-10-11)